[发明专利]基于duplex-seq的超低频突变位点检测分析方法

权利要求书

1.一种基于duplex-seq的超低频突变位点检测分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)对原始测序数据质量进行评估，降低数据噪声，为后续分析提供有效数据；

2)把随机barcode提取到序列文件的每一条序列的标题行，方便后续对barcode进行快速检索并创建一致性序列；

3)根据family barcode和duplex barcode创建一致性序列，排除由于建库过程或者PCR过程中引入的突变；

4)根据duplex-tag构建双链一致性序列，进一步排除序列中的非对称突变位点；

5)对经过上述步骤处理后的数据进行局部质量矫正，并进行低频变异位点检测；将变异位点进行基因结构、功能、及临床表型三个层次的注释；

6)统计SSCS、DCS序列数目、比对结果、变异位点信息，并输出可视化图表；

所述步骤3)包括如下步骤：

3.1)把步骤(2)中获得的序列，比对到相应的基因组获得比对文件；

3.2)获取比对文件中基因组的第一个位点；

3.3)对所有比对到步骤3.2)提取的位点上的reads进行flag字段的过滤，对于未比对上的reads则另存为NM文件；其中flag字段为77和141；

3.4)对所有通过步骤3.3)过滤后的reads根据duplex-tag进行排序，并进行分组；

3.5)提取步骤3.4)分组中的第一组duplex-tag及其相关序列；

3.6)对步骤3.5)中提取的一组序列根据CIGAR string进一步分组归类，对于含有相同CIGAR string的序列则进行下一步分析，对于不含有共同CIGAR string的序列则另存为LCC文件；

3.7)对步骤3.6)中分组的序列，计算其family size，如果family size小于3则丢弃该组序列，通过则进行下一步的分析；

3.8)对步骤3.7)中通过的一组序列创建单链一致性序列；对于碱基一致性较高的位点则该位点归一为含量较高的碱基，对于一致性不够好的序列则该位点以N代替；一致性的值根据用户自行定义，设置为70％；

3.9)通过3.8)构建的单链一致性序列，过滤掉含有30％以上N的序列，并输出最终合格的序列到单链一致性(SSCS)文件；

3.10)创建完SSCS后，如果含有更多的duplex-tag，则重复上述步骤3.6)-3.9)，如果没有则进入3.11)步骤；

3.11)若果还有更多的位点，则重复上述步骤3.3)-3.10)，否则结束该步骤；

所述步骤4)包括如下步骤：

4.1)将上述步骤3)中获得的单链一致性序列文件转化为sam格式文件，并去除familybarcode序列，方便下面创建双链一致性序列；

4.2)提取比对文件中的第一个基因组位点信息；

4.3)提取步骤4.2)中基因组位点对应的第一个duplex-tag；

4.4)寻找与步骤4.3)中的duplex-tag进行互补配对的duplex-tag，如果没有对应的duplex-tag与其进行匹配则该序列丢弃，如果有匹配的tag则进入步骤4.5)；

4.5)对含有相同duplex-tag的序列构建双链一致性序列；

4.6)对步骤4.5)创建的双链一致性序列进行过滤，如果序列中含有大量的N则该序列丢弃，否则进入步骤4.7)；

4.7)输出为双链一致性文件(DCS),并输出对应的配对序列R1、R2；

4.8在步骤4.5)创建完双链一致性序列后，如果还有更多的duplex-tag则重复步骤4.4)-4.7)，如果没有duplex-tag则进入步骤4.9)；

4.9)如果还有更多的位点需要分析，则重复步骤4.3)-4.8)；否则结束分析。