[发明专利]骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用

说明书

骆驼科抗体可变区免疫组库的引物组合、试剂盒以及构建方法。引物组合包括能够有效退火结合到驼科抗体V基因I家族的前导区的引物、能够有效退火结合到驼科抗体J基因区域的引物以及包含这些引物的引物组合。使用相应的引物组合进行三轮巢式聚合酶链式反应扩增后，直接可以构建出大容量的骆驼科抗体免疫组库上机文库。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用。

背景技术

重链抗体是Hamers-Casterman等于1993年在骆驼体内发现的一种天然缺失轻链，仅由重链所组成的抗体，所以被称为重链抗体(HCAbs)。此类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH单结构域形成。VHH是迄今为止已发现的具有结合抗原功能的最小分子量抗体片段之一，分子量为13-15KD，仅为常规抗体的1/10，因此又被称为纳米抗体(nanobody)。与传统抗体相比，VHH抗体分子量较小，易表达；在识别抗原表位时表现为更高的特异性和亲和力，并可识别独特构象的抗原表位；同时与传统抗体相比较具有高溶解性和稳定性等特点，因而对重要靶分子特异性的VHH抗体的研发成为近年来抗体新药制备的一种新策略。本发明所述骆驼科动物，包括但不限于双峰驼(Camelus bactrianus，Bactrian camel)，单峰驼(Camelus dromedarius)，大羊驼(llama，guanaco，alpaca)，小羊驼(vicuna)，驼羊(Alpaca Suri，lamagama)，骆马(vigogne)，美洲驼和澳洲驼等。

正常机体B细胞占外周血淋巴细胞总数的10-40％，多样性B细胞主要作用是产生抗体激发体液免疫应答。B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)是B细胞表面识别抗原的一种免疫球蛋白，具有抗原结合特异性。BCR是由两条重链和两条轻链组成的四聚体蛋白，其中，重链可以分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区以及胞质区，而轻链则只有V区和C区。V区由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)两个结构域组成，它们都由三个互补决定区CDR1，CDR2，CDR3构成，CDR的排列顺序和氨基酸组成都呈现出高度的多样性，在同一个个体内，B细胞克隆种类数可达10⁹-10¹⁰以上，构成容量巨大的BCR库，从而使个体拥有识别各种抗原、产生各种特异性抗体的巨大潜能。利用PCR技术构建B细胞免疫组库，测序后得到外周血中B细胞相应的巨大的BCR序列库，依照一定的生物信息序列筛选标准，可实现特异性抗体序列的筛选。免疫组库的库容和组成会直接影响后续筛选过程。因此本领域技术人员致力于构建大容量的免疫组库。

发明内容

本发明的目的在于提供骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用。

本发明的第一方面，提供了一种引物组合，所述引物组合中包括可以特异性退火结合到骆驼科抗体V基因I家族(Clan I)的前导区的第一上游引物。

在另一优选例中，所述第一上游引物包含选自下组的一种或多种引物序列：SEQID NO.11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、和44；优选地，所述第一上游引物序列如SEQ ID NO.11所示。

在另一优选例中，所述引物组合还包括下游引物；优选地所述下游引物序列如SEQID NO.45所示。

在另一优选例中，所述引物组合还包括第二上游引物，所述第二上游引物特异性退火结合到骆驼科抗体V基因III家族(Clan III)的前导区，优选地所述第二上游引物序列如SEQ ID NO.46所示。

在另一优选例中，所述引物组合还包括第三上游引物，所述第三上游引物特异性退火结合到骆驼科抗体V基因II家族(Clan II)的前导区，优选地所述第二上游引物序列如SEQ ID NO.53所示。