[发明专利]工程化的CRISPR-Cas9核酸酶

权利要求书

1.一种分离的酿脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，该蛋白的氨基酸序列为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中具有Q695A和Q926A两个突变，并且该蛋白任选地包含核定位序列、细胞穿透肽序列、和/或亲和标签中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的分离的蛋白，其包含以下全部四个位置处的突变：N497A、R661A、Q695A、和Q926A。

3.如权利要求2所述的分离的蛋白，其进一步包含在L169A、Y450A和D1135A位置处的一个、两个或全部三个位置处的突变。

4.如权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含在L169A、Y450A、N497A、R661A和D1135A位置处的一个、两个、三个、四个或全部五个位置处的突变。

5.如权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含以下突变中的一个或多个：D1135E；D1135V；D1135V/R1335Q/T1337R；D1135E/R1335Q/T1337R；D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R；或

D1135V/G1218R/R1335E/T1337R。

6.如权利要求1所述的分离的蛋白，其还包含降低核酸酶活性的选自下组的一个或多个突变，该组由以下组成：在D10A/D10N、E762Q、H983N/H983Y或D986N处的突变；和在H840A/H840N/H840Y或N863D/N863S/N863H处的突变。

7.如权利要求6所述的分离的蛋白，其中这些降低核酸酶活性的突变是：

(i)D10A或D10N，和

(ii)H840A、H840N、或H840Y。

8.一种融合蛋白，其包含使用任选的介入接头与异源功能结构域融合的、如权利要求1-7任一项中所述的分离的蛋白，其中该接头不干扰该融合蛋白的活性。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其中该异源功能结构域是转录激活结构域。

10.如权利要求9所述的融合蛋白，其中该转录激活结构域来自VP64或NF-κB p65。

11.如权利要求8所述的融合蛋白，其中该异源功能结构域是转录沉默子或转录阻遏结构域。

12.如权利要求11所述的融合蛋白，其中该转录阻遏结构域是克鲁贝尔相关盒(KRAB)结构域、ERF阻遏因子结构域(ERD)或mSin3A相互作用结构域(SID)。

13.如权利要求11所述的融合蛋白，其中该转录沉默子是异染色质蛋白1(HP1)。

14.如权利要求13所述的融合蛋白，其中该转录沉默子是HP1α或HP1β。

15.如权利要求8所述的融合蛋白，其中该异源功能结构域是修饰DNA的甲基化状态的酶。

16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中该修饰DNA的甲基化状态的酶是DNA甲基转移酶(DNMT)或TET蛋白。

17.如权利要求16所述的融合蛋白，其中该TET蛋白是TET1。

18.如权利要求8所述的融合蛋白，其中该异源功能结构域是修饰组蛋白亚基的酶。

19.如权利要求18所述的融合蛋白，其中该修饰组蛋白亚基的酶是组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、组蛋白甲基转移酶(HMT)或组蛋白脱甲基酶。