[发明专利]生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法

说明书

本文提供了用于指导人多能干细胞分化成内耳感觉上皮和感觉神经元的方法。更特别地，本文提供了用于获得包含以下的三维培养物的方法：人多能干细胞来源的耳前上皮、耳泡，以及含有毛细胞、感觉神经元和支持细胞的内耳感觉上皮。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月21日提交的美国临时申请No.62/244,568的权益，其通过引用如其全部内容所示并入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院授予的DC015624、DC012617和DC013294的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本文提供了用于指导人多能干细胞分化成内耳感觉上皮和感觉神经元的方法。更特别地，本文提供了用于获得包含以下的三维培养物的方法：人多能干细胞来源的耳前细胞上皮、耳泡、以及内耳感觉上皮，所述内耳感觉上皮含有毛细胞和支持细胞，以及支配感觉上皮的感觉神经元。

背景技术

全世界有近5亿人患有听力损失，但并没有可以治疗听力损失的药理学、遗传学或细胞治疗。这种方法可用于生成人内耳干细胞、支持细胞、毛细胞和神经元以用于细胞治疗或用于药物发现。

因此，本领域仍然需要用于使人多能干细胞分化成适用于临床细胞治疗的内耳感觉组织的高效的、可重复的、并且无异种材料的方法。

发明内容

在第一方面中，本文提供了获得人耳前上皮细胞的方法。如本文所述，所述方法包括：(a)在包含骨形态生成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)和转化生长因子β(Transforming Growth Factor Beta，TGFβ)信号传导抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体约8天至约10天；(b)在成纤维细胞生长因子(Fibroblast GroMh Factor，FGF)和BMP信号传导抑制剂的存在下进一步培养(a)的经培养的聚集体约4天；和(b)使(b)的经进一步培养的聚集体接触Wnt激动剂约4天，由此经接触的聚集体内的细胞分化成耳前上皮细胞。FGF可以是FGF-2。BMP可以是BMP2、BMP4或BMP7。BMP信号传导抑制剂可以是LDN-193189。TGFβ1介导的信号传导的抑制剂可以选自SB431542和A-83-01。Wnt激动剂可以是GSK3抑制剂。GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。

在另一个方面中，本文提供了获得包含人内耳感觉组织的三维组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将根据权利要求1所述的方法获得的人耳前上皮细胞包埋在包含细胞外基质蛋白的半固体培养基中；和(b)在促进包埋的耳前上皮细胞自组装成耳泡的条件下，在Wnt激动剂的存在下培养包埋的耳前上皮细胞约40天至约60天，由此获得包含人内耳感觉组织的三维组合物。Wnt激动剂可以是GSK3抑制剂，其中GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。细胞外基质可以是基底膜提取物(basementmembrane extract，BME)。三维组合物可以包含一种或更多种机械感觉细胞。三维组合物可以包含一种或更多种感觉神经元细胞。三维组合物可以包含一种或更多种与机械感觉细胞形成突触连接的感觉神经元细胞。

在考虑以下附图、详细描述和所附权利要求后，将更好地理解本文描述的这些和其他特征、方面和优点。

附图说明