[发明专利]使用光可裂解标记进行抗原检测

说明书

本申请要求2015年8月6日提交的美国临时申请号62/201,978的优先权，其全部内容以引用方式并入本文。

背景技术

1.技术领域

本发明整体涉及组织学、病理学和分子生物学的领域。更具体地讲，涉及使用光可裂解标记(PCL)进行抗原检测，包括例如进行多重和连续抗原检测。

2.相关领域的描述

在通常使用的免疫染色方案中，将抗原特异性抗体加入到含有抗原的标本(包括但不限于组织切片、细胞或蛋白质印迹)中并使其与抗原结合。然后使用多种技术中的任一种来检测这种抗原结合性抗体，该技术包括(a)将对第一抗体具有特异性亲和力的第二抗体与荧光团(例如，Cy5)或用于比色检测的酶(例如，HRP)缀合；(b)将对第一抗体具有特异性亲和力的第二抗体与生物素缀合，该生物素随后使用与荧光团(例如，Cy5)或用于比色检测的酶(例如，HRP)缀合的抗生物素蛋白或链霉亲和素进行检测；以及将(c)荧光团(例如，Cy5)或用于比色检测的酶(例如，HRP)或生物素与第一抗体直接缀合。在情况(a)和(b)中，此类技术允许在同一样品上使用约三种抗体，每种抗体被独特地标记。在情况(c)中，此类技术限于与可分别成像的不同标记缀合的约四种抗体。然而，二级抗体之间的非特异性相互作用和检测单独标记的有限能力阻止了更高阶的复合。正在涌现新的多重技术，但许多都有缺点，例如，耗时、昂贵和/或需要广泛优化的一级抗体。需要改进的用于自动化抗原检测的方法和仪器。

发明内容

本文提供了使用光可裂解标记进行多重和连续抗原检测的方法。该方法包括检测光可裂解标记的存在，该光可裂解标记通过官能连接基与抗原结合复合物缀合，该抗原结合复合物继而与抗原非共价结合。因此，光可裂解标记的存在指示由抗原结合复合物特异性或选择性结合的抗原的存在。

在一个方面，提供了用于检测样品上或样品中的至少第一抗原的存在的方法，该样品包括能够特异性结合该第一抗原的第一抗原结合复合物，该方法包括检测样品中的光可裂解标记的存在，其中该光可裂解标记通过官能连接基与该第一抗原结合复合物缀合，其中该第一抗原结合复合物与该第一抗原非共价结合形成式(I)的抗原结合性抗原结合复合物：

抗原

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抗原结合复合物

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官能连接基

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光可裂解标记，

其中该光可裂解标记的存在指示该第一抗原的存在。

在一些实施方案中，该方法还包括光裂解该光可裂解标记。光裂解可包括使样品暴露于紫外光。

在一些实施方案中，光可裂解标记包括与光可裂解部分共价缀合的报道分子部分。光可裂解部分可以是2-硝基苄基基团、苯偶姻基基团、香豆素基基团或对羟基苯甲酰基基团。在各种实施方案中，光可裂解部分是2-硝基苄基基团。在某些实施方案中，2-硝基苄基基团包括在α-碳和/或苯环上的取代。

在一些实施方案中，官能连接基是单链寡核苷酸、至少部分双链寡核苷酸、肽或链烷二基(alkanediyl)_(C≤16)。在某些实施方案中，该至少部分双链寡核苷酸是发夹寡核苷酸。在某些实施方案中，该至少部分双链寡核苷酸是完全双链寡核苷酸。

在一些实施方案中，第一抗原结合复合物由式(II)定义：

一级抗体

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缀合部分，

其中该第一抗原结合复合物包括与缀合部分结合的一级抗体，其中该抗原结合性抗原结合复合物由式(III)进一步定义：

抗原

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一级抗体

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缀合部分

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官能连接基

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光可裂解标记。

在一些实施方案中，该一级抗体被至少一种还原剂(诸如例如，TCEP或2-MEA)修饰。在一些实施方案中，该缀合部分是异双官能连接基，诸如例如磺基-SMCC或SM(PEG)n。在一些实施方案中，该缀合部分与一级抗体共价连接。在一些实施方案中，该缀合部分与官能连接基共价连接。在一些实施方案中，该官能连接基是在5'末端具有C6氨基修饰且在3'末端具有光可裂解标记的部分双链寡核苷酸。

在一些实施方案中，该第一抗原结合复合物由式(IV)定义：

一级抗体

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第一配体

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第一抗配体，