[发明专利]用于控制待冰冻的生物样本中的冰核形成的装置

说明书

发明领域

本发明大体涉及用于控制冰形成的装置、方法和系统。

发明背景

生物材料(例如，细胞、疫苗和蛋白质)通常需要保存。例如，生物材料可能需要保存，以便它们可以在以后的时间点在科学实验中被研究或使用。在另一示例中，作为体外受精(IVF)过程的一部分，可以保存人体卵母细胞或受精胚胎。在这些实施例中，以使对生物材料的损害或劣化最小化的方式保存生物材料是重要的。冰冻技术常用于保存生物材料。有不同的方式冰冻生物材料以保存它们。例如，冷冻保存为将生物材料冰冻并然后以冰冻状态储存的过程，而冰冻干燥(冻干)为将生物样本冰冻并在冰冻步骤之后，从样本中除去水，使得样本以干燥状态储存的过程。

冷冻保存是广泛采用的用于保持生物样本的长期生存力以便随后在医学、生物技术和兽医学领域应用的技术。为了在解冻时获得高生存力，有必要加入也称为冷冻保护性添加剂的保护性化合物，并且然后以受控的速率冷却样本。对于许多细胞类型，还有必要通过受控的成核而不是允许自发的冰核形成(ice nucleation)来诱发冰形成。用于冷冻保存的样本通常放置在专门的冷冻容器中，诸如：

·为薄壁管的吸管，其直径通常为2mm至4mm，长度可达140mm，容量为0.2ml至0.5ml；

·冰冻瓶，其为直径较大(直径通常为12.5mm)且容量为0.5ml至5.0ml的短管；

·袋，容量从5ml到1000ml的一系列柔性袋可用于较大体积的冷冻保存；以及

·多套管板(multiwell plate)、基质管和在机器人技术、高通量筛选等中采用的其他SBS(生物分子科学学会)样式。

存在一系列器具以允许样本在冰冻容器中的受控速率冰冻；这些装置可采用液氮作为冷冻剂或通过机械冷藏来冷却。此外，存在许多无源冷却装置。在受控速率冰冻后，样本在通常为液氮温度(-196℃)的低温下保持冰冻。在此温度下，如果细胞在冷却阶段存活，则细胞生存力与储存期无关。当需要使用时，样本被快速解冻，通常被保持在37℃的水浴中，并且冷冻保护剂被去除。

冰冻干燥(冻干)广泛用于生物技术、医药和兽医科学，以用于长期稳定细胞、疫苗、蛋白质和其他生物活性化合物。冰冻干燥过程也用于生成结构化材料，诸如应用于再生医学和新型陶瓷生产的支架和基片。在冰冻干燥过程中，将含水样本置于通常为玻璃小瓶的专门容器中并被冰冻。通常，冰冻发生在冰冻干燥器的冷却架上。冰冻后，局部气体压力降低，然后冰冻样本内的冰升华。从样本中去除所有的水后，将小瓶在真空下升温并密封。样本可在环境温度下分布，并通过加水重构。

一致的冰核形成是冷冻保存中最大的挑战。当液体被冷却至其熔点时，不会立即发生冰核形成。样本可达到在其熔点以下20℃或更多，而不会发生冰核形成，这种情况被称为“过冷却”或“过冷”。随着样本的温度降低，在某一温度下会发生自发冰核形成并且冰将会在整个样本中扩展。

一些类型的细胞是坚固的，并且不会受过冷却的不利影响。但是许多类型的细胞可能被过度的过冷却损坏，这会在解冻后降低细胞生存力。由于冰核形成的可变性质，样本生存力之间可能存在很大差异。这产生各种不利的商业后果：

1.保证在冰冻和解冻后样本中存在一定数量的活细胞的公司必须过量填充样本以补偿存活力范围。如果可以减少细胞的变异性(variability)，则需要较低的细胞数量，同时仍然保证最小的存活数目。这将大大降低成本。

2.除细胞的变异性之外，如果可以提高整体生存力，则对于相同生产成本而言，总产量将更高。

3.使用具有冰冻并解冻的贴壁细胞的多套管板(例如，96个套管的板和384个套管的板)进行高通量筛选对于许多感兴趣类型的细胞(肝细胞、肌细胞、干细胞系等)来说是不可能的。细胞的背景变异性导致“噪声”太多难以识别任何有意义的测试结果。这迫使公司使用制备有贴壁细胞(即未冰冻的)的“新鲜”的多套管板或从单个冰冻源对多套管板进行引晶。这两个选项都会花费大量时间和成本，同时使多套管测试的逻辑复杂化。

过冷的水溶液中的冰核形成可通过两种不同的过程发生：

1)同质冰核形成简单地通过水体内的随机密度波动发生，充分描述了此类分子簇的生长和消减的历程以及它们作为用于使冰结晶的核的能力。

2)异质或促进的冰核形成由与水接触的固态或液态基质催化，其允许吸附的水分子组呈现能够促成冰形成的构型。实际上，冷冻保存样本中的冰核形成通过异质机制发生。

为了降低冷冻保存期间经历的冰核形成温度的范围，已经采用了许多物理方法来诱发样本内的冰核形成。