[发明专利]免疫标记复合物的形成方法及用途

说明书

技术领域

本发明一般涉及用于形成免疫标记复合物的方法，所述免疫标记复合物包括标记的单价生物素结合的组合物。本发明还涉及抗原-报道分子复合物用于检测样品中靶标的用途。

背景技术

在免疫标记中，抗体用于检测生物和非生物样品中的分子。抗体是通过其抗原结合位点以高特异性结合至抗原（靶分子）的免疫球蛋白（Ig）蛋白。通常，靶分子是蛋白质，但可以是任何免疫原性试剂，例如多糖，脂质，毒素等。结合至抗原的目标分子的一部分成为（抗原）表位。用于免疫标记的抗体可以是多克隆或单克隆（抗体）。多克隆抗体是识别一个靶分子的多个（抗原）表位的抗体的不均匀混合物，而单克隆抗体对单个（抗原）表位显示特异性。通常，单克隆抗体产生更多特异性的免疫标记信号。

免疫标记可以是直接或间接的。直接法是一步标记的方法，并且包含用报道分子标记的一抗。报道分子（标记）是可以产生信号的分子，例如酶或荧色物（下文进一步描述）。当标记的一抗被添加到样品中时，其结合并揭示靶分子的位置和/或量。由于直接方法使用仅和样品的一个培育步骤，因此，它简单快速。

间接法是两步标记方法，其导致信号扩增。它包含一抗结合至样品中的靶分子（第一步）和标记的二抗结合至已结合的一抗（第二步）。由于多个标记的二抗分子与每个一抗分子结合，与直接法相比，报道信号将被扩增。然而，间接法需要一个额外的培育步骤，并且二抗需要仔细调整至一抗。通常针对动物物种的Ig类产生二抗，动物物种的Ig类中产生一抗。例如，如果一抗是小鼠IgG抗体，则二抗是抗小鼠IgG抗体。如果一抗是兔IgG，则二抗是抗兔IgG等。

链霉亲和素（或亲和素的其他衍生物）也可以通过使用生物素化抗体的间接法用于免疫标记中。生物素化抗体是与生物素分子（通常为3-10个生物素分子/抗体分子）共轭的抗体。链霉亲和素与生物素强力结合，因此可用作生物素化抗体的第二试剂。在一些应用中，当样品的性质为可塑的，例如活细胞的膜，常规的链霉亲和素可以引起抗体的聚集。这是因为每个链亲和素分子具有四个生物素结合位点，当作为第二试剂加入时，它可以结合在样品中“漂浮”的多个生物素化的抗体。为了避免这种现象，已经设计了单价形式的链霉亲和素（Howarth M et al, Nature methods, 2006）。单价链霉亲和素具有一个生物素结合位点。因此，它可以用作第二试剂以使生物素化的抗体可视化，生物素化的抗体结合至活细胞膜中的靶分子而没有抗体聚集的风险。

用于免疫标记的报道分子根据检测方法的性质而变化。它们直接附着（共轭）至一抗（直接法）或至二抗/链霉亲和素（间接法）。报道分子通过导致报道分子和抗体之间的共价键的化学反应共轭至抗体。因此，报道分子和抗体成为一个单元。通常，多个报道分子共轭至每个抗体分子。最常见的报道分子为用于显色检测的酶或用于荧光信号的荧色物。其他实例为颗粒（例如金颗粒，量子点），磷光化合物（例如碳氰酸染料），放射性化合物（例如3H或32P标记的分子）和过渡金属（用于质谱）。对于某些类别的报道分子，如荧色物和过渡金属，可以在一个样品内同时分离和分析多个信号。这意味着可以在一个样品内同时免疫标记和检测多种不同的靶分子。该多重免疫标记技术例如通常用于荧光显微镜和流式细胞术。

由于报道元件的选择在实验/应用之间变化，因此非常希望在抗体上转换报道分子。然而，在直接法中，报道分子和抗体作为一个单元牢固地彼此附着。因此，如果新的报道分子是优选的，则必须获得新的报道分子-抗体单元，而不是改变报道分子。

在这个意义上，间接法更灵活，因为报道分子附着至二抗。因此，可以通过用不同报道分子在二抗之间切换来改变报道分子。然而，如上所述，该技术需要与样品进行额外的培育步骤。此外，二抗的使用引起抗体交叉结合的问题，即二抗不仅结合其旨在结合的一抗，而且还结合其他不希望的抗体。这些其他抗体可以是1）组织内的内源性抗体，2）其他一抗，和3）其他二抗。该问题产生于二抗结合来自相同动物物种的所有抗体。因此，每种一抗需要具有不同的抗体类别（动物物种），并且每种二抗必须仅选择性地识别这些类别之一。另外，二抗都不能是任何其他二抗识别的抗体类别。这是本领域众所周知的问题，并且极大地限制了可以在多重免疫标记中组合的抗体的数量。