[发明专利]由多能干细胞向角膜上皮细胞的分化诱导

权利要求书

1.制备下述集落的方法，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层，所述方法中，在不使用饲养细胞的情况下于无血清培养基中对多能干细胞进行二维培养，由此制备所述集落。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过多能干细胞的自主分化，形成由不同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，无血清培养基不含有0.5nM以上的BMP4(骨形态发生蛋白4)、转化生长因子、及激活素。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，无血清培养基还不含有选自高浓度视黄酸、BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、及头蛋白中的至少1种以上。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，使用经选自胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或层粘连蛋白片段、玻连蛋白、基底膜基质、明胶、透明质酸、多聚赖氨酸、玻连蛋白、及透明质酸中的任意一种以上包被的容器来培养多能干细胞。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，集落包含分别由神经外胚层系列细胞、神经嵴系列细胞/眼胚系列细胞、眼表外胚层系列细胞、及表面外胚层系列细胞构成的层。

7.眼相关细胞的制备方法，其包括下述步骤：

通过权利要求1～6中任一项所述的方法制备集落的步骤，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层；

从所述集落中分离特定的层中包含的细胞的步骤；及

将所述细胞分化诱导为眼相关细胞的步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其中，眼相关细胞为选自角膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、神经视网膜细胞、结膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞、角膜内皮细胞、角膜基质细胞、虹膜基质细胞、巩膜细胞、虹膜色素上皮细胞、睫状体上皮细胞、视神经细胞、角膜缘下成纤维细胞、结膜下成纤维细胞、泪腺、睑板腺、杯状细胞、晶状体上皮细胞、及眼睑上皮细胞中的任一种。

9.角膜上皮细胞的制备方法，其包括下述步骤：

通过权利要求1～6中任一项所述的方法制备集落的步骤，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层；

在含有生长因子的培养基中培养所述集落的步骤；

分离由眼表外胚层系列细胞构成的层中包含的细胞，在含有KGF、Rock抑制剂、及血清替代物的培养基中进行培养，从而分化诱导为角膜上皮前体细胞的步骤；及

将角膜上皮前体细胞单独分离出，并分化诱导为角膜上皮细胞的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，以选自ITGβ4、SSEA4、TRA-1-60、及CD200中的1种或2种以上的标志物有无表达作为指标，来单独分离角膜上皮前体细胞。

11.角膜上皮细胞，其特征在于，所述角膜上皮细胞是通过权利要求9或10所述的方法制备的，并且为K12、pax6、及p63阳性。

12.角膜细胞片的制备方法，其包括下述步骤：通过权利要求9或10所述的方法制备角膜上皮细胞的步骤；将得到的角膜上皮细胞进一步进行复层化培养的步骤。

13.集落，其包含由来源于多能干细胞的各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层。

14.如权利要求13所述的集落，其是利用权利要求1～6中任一项所述的方法制备的。

15.复层化角膜上皮细胞片，其特征在于，所述复层化角膜上皮细胞片来源于多能干细胞，并且，角膜上皮细胞为K12、pax6、及MUC16阳性。

16.角膜上皮细胞，其是通过将权利要求13或14所述的集落的由眼表外胚层系列细胞构成的层中包含的细胞进行分离·培养而制备的来源于多能干细胞的角膜上皮细胞，其特征在于，所述角膜上皮细胞为K12、pax6、及p63阳性。