[发明专利]组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用

说明书

本发明属于植物生物技术领域，具体地，涉及一个植物修复模式植物印度芥菜BjCET1P启动子的克隆、功能鉴定和应用，其核苷酸序列如Seq ID No:1、2或3所示。该启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因在植物根、茎、叶、花等器官中呈组成型高效表达，在各种非生物逆境处理条件下也具有很强的表达活性，其表达强度远高于CaMV35S启动子，且该启动子片段大小适中，利于构建，在用于培育人工超富集植物及植物转基因研究领域具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及植物转基因工程领域，具体地，组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用。

背景技术

在植物宿主中外源基因的表达是通过连接到特定的启动子下游实现的，因此，选择什么类型的启动子便决定了外源基因在植物体内表达的时空分布。启动子类型通常分为组成型、组织特异型和诱导型三大类，在植物转基因研究中，由于组成型启动子表达持久、高效和稳定，在应用上最为广泛,目前常用的有CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin-1启动子和水稻的Actin1启动子等。

植物重金属超富集植物是自然界中发现的比普通植物能在植物体内累积100-1000倍以上的一类植物，在利用植物修复技术清除污染的土壤和水体方面具有巨大的研究和应用价值。经过近几年的研究发现，其中CDF/CE(cation diffusion faciliator/cation-efflux)家族金属跨膜转运蛋白成员的持续高水平表达发挥了重要作用(Milneret al，2012；Lang et al，2011；Persans et al，2001)。该家族基因在提高普通植物重金属耐性和累积量的有效性已有研究报道(Van der zaal et al,1999；Lang et al，2011；)，然而有关其中启动子的研究还少有报道。研究和利用植物本身来源的强启动子来提高目的蛋白在植物体内的高效、稳定表达，增强转基因生物安全，对于构建人工重金属超富集植物和植物转基因研究具有重要的科学意义和应用价值。

印度芥菜(Brassica juncea L.)对多种重金属离子(如Zn、Cd、Co、Ni、Pb、Cs等)具有超富集能力，是植物修复技术的主要模式植物之一。开发和利用植物本身的高强度启动子对于增强转基因植物修复污染土壤的效率显得尤为必要。

本发明从印度芥菜中克隆了其CDF/CE家族蛋白基因BjCET1的启动子，命名为BjCET1P。通过实验分析，发现BjCET1P启动子自翻译起始位点ATG往上-1000bp和-2000bp的启动子片段均呈现出很强的组成型表达特性。在正常培养条件下，BjCET1P转基因拟南芥中，其所驱动的GUS报告基因在根、茎、叶和花等器官中都表现出很强的表达水平，高出对照CaMV35S启动子约15倍左右，并且GUS表达水平稳定，几乎不受环境因子诱导。这些数据充分表明BjCET1P为一个很强的组成型表达启动子，可用于植物高效表达载体的构建。目前为止，还没有关于BjCET1P强启动子的报道。

发明内容

本发明的目的是提供组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用。

本发明从印度芥菜中克隆获得了一个新的组成型强启动子，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码起-2000bp调控区的启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎、叶、花中均能高效表达。该启动子是通过染色体步移技术获得BjCET1基因5′端上游约2000bp序列，经转录起始位点分析发现，印度芥菜BjCET1基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-83nt处，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX和CAAT-box，还包含多种功能元件，如高效转录元件(5'UTR Py-richstretch)、光应答元件(Box-4G-Box GA-motif)、厌氧应答元件(ARE)、分生组织表达应答元件(CAT-box)、脱落酸应答元件(ABRE)、生长素应答元件(TGA-element)、抗旱应答元件(MBS)、低温应答元件(LTR)和防御和胁迫应答元件(TC-rich repeats)。