[发明专利]一种丝素荧光探针的制备方法

说明书

本发明公开了一种丝素荧光探针的制备方法。用丝素材料对噬菌体库进行筛选，得到与丝素蛋白特异性结合的噬菌体，进行基因测序，将测序获得的基因对应的氨基酸序列作为丝素亲和肽一级序列，通过多肽合成技术对丝素亲和肽一级序列进行多肽合成，得到丝素亲和肽粉，将丝素亲和肽粉和荧光素结合，得到丝素荧光探针。本发明所筛选的噬菌体对丝素材料具有很高的亲和性，探针灵敏度高，检测速度快，应用前景广泛，为丝素蛋白及丝素材料的高效靶向、鉴定提供更多的选择。

技术领域

本发明涉及一种丝素荧光探针的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

生物大分子如蛋白质和多肽，具有生物相容性、功能性和多样性，是自然界生物的重要组成部分，也是人类用于改造自然，提高生活质量的必要的原料。因此，对材料中蛋白质进行定性和定量分析具有及其重要的作用，常要用具有高度灵敏度的生物学方法。对蛋白质含量鉴定和定量的传统方法有双缩脲法、酚试剂法法及紫外吸收法等，但这些传统的方法存在灵敏度低、非特异性测定的缺点。随着科学技术的进步，质谱特别是飞行时间质谱(MALDI-TOF)已成为鉴定光谱性蛋白质的重要技术。MALDI-TOF对蛋白质进行检测时主要有2个步骤：离子反射器和延迟提取，从而达到对样本中蛋白质含量的测定。这一技术能够完成对极低含量的蛋白质进行检测，提高了蛋白质的检测灵敏度。

丝素蛋白是一种天然的高分子，由于其独特的力学性能和良好的生物相容性、降解性和稳定性，易于加工与修饰，以及本质是蛋白质的结构特点，成为制药、化工、食品添加剂和组织工程等领域中引人注目的一类生物材料。由于丝素蛋白具有生物降解性、生物相容性、生物可降解性和可加工性等优良性能，可制备成多种形态的材料，如多孔状、膜状、纤维状和管状等，在科学研究中受到广泛的关注和研究。丝素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸等18种氨基酸组成。虽然上述方法或技术能够对蛋白质进行检测，但仍然不能对丝素蛋白进行特异性鉴定，尤其是在含有其它蛋白质的干扰下，不能够对丝素蛋白进行定性及定量。

丝素分子量最高可达350KDa，低分子量的丝素蛋白也有20kDa，且在这一区间存在很大的一个分子量跨度，因此丝素蛋白一级结构和多级结构复杂；尤其当丝素蛋白与其它蛋白混合后，普通方法难以对丝素进行定性和定量。因此开发出一种针对丝素蛋白进行特异性鉴别的探针具有很大的挑战性。综上所述，至今为止还没有出现一种高效、简单的方法对丝素蛋白或丝素材料进行特异性鉴别和定量。

发明内容

荧光探针技术是影像技术中重要研究内容,通过静电应力、化学反应、氢键作用等方法将拟检测的对象(如生物分子、组织、材料等)在特定波长激发下产生荧光并被肉眼或者仪器检测的过程。

针对传统制备技术中存在的不足，本发明提出了一种丝素荧光探针的制备方法，以噬菌体筛选得到的丝素亲和肽为中心，通过与荧光素接枝，得到特异性检测丝素材料的荧光探针，该方法简单一步合成。

本发明的技术方案是采用如下步骤：

1)用丝素材料对噬菌体库进行筛选，得到与丝素蛋白特异性结合的噬菌体；

2)对步骤2)获得的与丝素蛋白特异性结合的噬菌体进行基因测序，将测序获得的基因对应的氨基酸序列作为丝素亲和肽一级序列；

3)通过多肽合成技术对步骤(2)得到的丝素亲和肽一级序列进行多肽合成，得到丝素亲和肽粉；

4)将步骤(3)得到的丝素亲和肽粉和荧光素结合，得到丝素荧光探针。

本发明实施例中将步骤(4)得到的丝素荧光探针进行鉴定与应用，丝素荧光探针能够对丝素材料或者含有丝素蛋白的材料进行特异性结合并被荧光显微镜检测到。

所述步骤1)具体为：

a.封闭丝素材料：将丝素材料加入含有TBS和BSA的缓冲液，TBS和BSA各自的浓度为0.1-10mg/ml；