[发明专利]一种以胆酸为配基的混合模式色谱填料的制备与应用

说明书

本发明提供一种制备和应用以胆酸为配基的具有高效疏水相互作用/弱阳离子交换混合模式色谱填料的方法。将胆酸作为固定相配基，在硅胶基质表面化学修饰获得了新型的混合模式色谱填料。该填料装填的色谱柱采用盐‑水为洗脱体系，对天然蛋白质分离具有高的选择性和负载量且性能稳定；将其应用于鸡蛋清样品的分离，可分别在HPHIC模式和HPWCX模式下，获得纯度为99.9％的卵球蛋白(ovoglobulin)和99.8％的卵转铁蛋白OVT(ovotransfemin)，其蛋白质量回收率均在97％以上。

发明领域

本发明涉及一种以胆酸为配基，疏水相互作用为主，阳离子静电作用为辅的模式色谱填料的制备方法及其用于鸡蛋清的纯化与分离，属于高效液相色谱技术和天然生物大分子分离纯化技术交叉领域。

背景技术

目前，已有许多类型的混合模式色谱(MMC)迅速发展，常见的有反相液相色谱(RPLC)/离子交换色谱(IEC)、RPLC/亲水相互作用色谱(HILIC)；HILIC/IEC、疏水相互作用色谱(HIC)/IEC或IEC/HIC，其中由于HIC/IEC和IEC/HIC模式具有分离条件温和，组分活性回收率高，色谱重现性好，以及流动相成本低、对环境污染小等特点，显示出优越的应用前景[Johansson B.L.，Belew M.，Eriksson S.，Glad G.，Lind O.，Maloisel J.L.，NorrmanN.Journal of Chromatography A，2003，1016：21-33.]。研究表明，在MMC法中，一种是多重作用力均具有主要作用的保留模式，另一种是主、辅机理的LC模式保留机制。前者如Geng等报道的单柱二维液相色谱(2D-LC-1C)不但打破了一维模式分离的局限性，还节省了色谱材料，缩短了分离所需时间[Geng X.D.，Ke C.Y.，Chen G.，Liu P.，Wang F.，Zhang H.Q.，Sun.X.Journal of Chromatography A，2009，1216：3553-3562.]。后者如用一种具有一个疏水基团(苯基)和一个带电基团(氨基)的苯乙胺分子作为配基制备的硅胶填料，在以疏水相互作用(HIC)为主，弱阴离子交换(WAX)为辅的MMC模式下对可以实现还原变性溶菌酶复性与同时纯化[Gao D.，Tan F.C.，Wang W.P.，Wang.L.L.Chinese Chemical Letters，2013，24：419-421.]。在以往报道中，我们用胆固醇作为配基制备了一种高效疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相，研究显示，该固定相疏水性适中可以实现酸性蛋白胰岛素(Insulin，pI5.0)，中性蛋白肌红蛋白(myoglobin，pI 7.0)以及3种碱性蛋白(α-chymotrypsin A，pI9.2；cytochrome c，pI 9.4；lysozyme，pI 11)的基线分离，完全显示出HIC法保留机制[Yang Y.C.，Qu Q.，Li W.M.，Yuan J.，Ren Y.，Wang L.L.Journal of SeparationScience，2016，39：2481-2490]。

胆酸是胆固醇的一种衍生物，学名3α，7α，12α-三羟胆烷酸，是人类四种主要胆汁酸中含量最丰富的一种。通常胆酸可通过乙醇结晶法、乙酸乙酯分离法从动物胆汁中提取。胆酸分子含有特殊的羧基、羟基的亲水基团和多环刚性的疏水基团，与胆固醇分子结构上相似，但其基团完全不同。

本发明以胆酸分子作为色谱配基，制备一种以硅胶为基质，疏水相互作用为主，阳离子静电作用为辅的混合模式色谱填料，并将该填料应用于鸡蛋清的纯化与分离。

发明内容

本发明的目的在于将胆固醇的一种衍生物胆酸作为色谱填料配基，制备一种以疏水作用为主，阳离子静电作用为辅的混合模式色谱填料，该固定相是一种性能稳定、具有高选择性的高效疏水相互作用/弱阳离子交换混合模式色谱固定相，将该填料应用于鸡蛋清的纯化与分离，分别在高效疏水相互作用模式和弱阳离子交换模式下，获得纯度为99.8％的卵球蛋白(ovoglobulin)和99.5％的卵转铁蛋白OVT(ovotransfemin)，其蛋白质量回收率均在96％以上。