[发明专利]一种动物细胞胞内能量代谢物提取及含量测定方法

说明书

本发明提供了一种动物细胞胞内能量代谢物提取及含量测定的方法，包括步骤：制备待测样品、取包括NADH、NAD⁺、NADPH、NADP⁺、ATP、ADP、AMP、或其组合的标准品溶于水中，制得标准溶液、将待测样品与磷酸钾基质液混合，调节pH为5.0‑7.0，然后加入至含硼酸盐缓冲液的毛细管中，进行电泳分离。本发明的提取及检测方法操作简单、准确、重复性好，能够较好地同时检测动物细胞胞内7种能量代谢物。

技术领域

本发明属于化学品提取及检测领域，具体地说，本发明涉及一种动物细胞胞内能量代谢物提取及含量测定方法。

背景技术

近年来，动物细胞尤其是中国仓鼠卵巢细胞被广泛应用于大规模表达治疗用单克隆抗体及融合蛋白。虽然动物细胞培养技术在过去的几十年间得到高速发展，但在实际生产过程中工程师对细胞培养过程的精密调控仍存在很大难度。细胞培养作为一个动态过程，细胞与外界不断进行着物质和能量的交换，因此深入了解细胞胞内的代谢变化更有助于精确地调控细胞培养过程。

以NAD⁺、NADH、NADP⁺、NADPH为代表的吡啶核苷作为一类参与生物体内关键分解代谢和合成代谢通路的辅酶因子，在电子链传递、生物合成、维持细胞氧化还原状态方面发挥巨大作用。腺苷类物质(ATP、ADP、AMP)在绝大多数生物耗能过程中作为供能体存在。因此如何快速准确地检测胞内能量代谢物质对动物细胞大规模培养过程中的工艺开发和优化将起到关键作用。

检测细胞胞内能量代谢物含量的常用方法包括分光光度法、荧光法和高效液相色谱分离方法等，但这些方法相较于毛细管电泳方法操作繁琐，耗费样品体积大，而且经济效益较低。

综上所述，本领域迫切需要研发出操作简便、高效的检测细胞胞内能量代谢物含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取效果好，分离度高，重现性好，分析成本低，可同时检测7种能量代谢物的提取及检测方法。

本发明第一方面，提供一种测定动物细胞胞内能量代谢物含量的方法，所述细胞胞内能量代谢物选自下组：NADH、NAD⁺、NADPH、NADP⁺、ATP、ADP、AMP、或其组合，所述方法包括步骤：

(a)制备待测样品

(1)取细胞悬液，与生理盐水混合均匀，离心，去除上清液，得到细胞沉淀物I，其中所述细胞悬液和生理盐水的体积比为1:1:-1:100(较佳地为1:2-1:60，更佳地为1:3-1:50)；

(2)将步骤(1)所得的细胞沉淀物I与乙腈提取液混合均匀，冰浴，离心，去除上清液，得到细胞沉淀物II；

(3)将步骤(2)所得的细胞沉淀物II浓缩至干燥，制得所述待测样品；

(b)取包括NADH、NAD⁺、NADPH、NADP⁺、ATP、ADP、AMP、或其组合的标准品溶于水中，制得标准溶液；

(c)将步骤(3)所述待测样品与磷酸钾基质液混合，调节pH为5.0-7.0，然后加入至含硼酸盐缓冲液的毛细管中，进行电泳分离；和

(d)任选地，计算待测样品中能量代谢物的浓度。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述离心在0-4℃下进行。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述离心时间为0.1-5min，较佳地为0.5-3min，更佳地为1-2min。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述乙腈提取液中乙腈终浓度为20％-80％(V/V)，较佳地为40％-60％(V/V)。