[发明专利]一种蕨类孢子灭菌及接种方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种适于离体保存过程中蕨类孢子灭菌方法及接种，

背景技术

我国的蕨类资源十分丰富，约有2600种，占全世界的1/5，其中很多是中国特有。蕨类植物不仅在生物进化和植物系统发育的研究中起着重要作用，也与人类生活联系密切，许多蕨类植物在药用、观赏等众多方面具有重要价值。可见，关于蕨类的商品化生产和栽培育种的开发具有广阔前景。蕨类植物组织培养过程中，以孢子作为外植体进行组织培养具有不损害母株、繁殖系数大等优点，是蕨类植物生产上使用最广泛的繁殖途径。蕨类孢子非常微小，呈粉尘状，在进行无菌播种时，常用的方法有滤纸包裹或置于离心管等器皿中，再用次氯酸钠或氯化汞消毒，无菌水多次冲洗后接种。由于蕨类孢子过于微小，在多个物种同时接种时，包裹法容易将孢子漏出造成混种，而多层的滤纸包裹又可能导致灭菌不充分；而离心灭菌法的操作过程中，其废液去除困难，容易将孢子吸走，或因消毒液残留而潜在延长灭菌时间，进而导致孢子失活。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，借助当前普遍可得的DNA纯化柱(包含吸附柱和收集管)提供一种操作简便，效率高，适于离体保存过程中的蕨类孢子灭菌及接种方法。

为实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：

收集孢子，把蕨类孢子叶装入硫酸纸袋中，标记代号后置于通风干燥处，待孢子自由脱落；把DNA纯化柱(规格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；用对折过的硫酸纸收集脱落在纸袋中的孢子，简单的去除碎叶、环带、鳞毛等杂质后沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子，放入收集管中，并做好标记，放置于离心管架上；在无菌条件下，加入600μl 75％乙醇，倒立纯化柱1-2次，之后200-1200rpm离心20s。从加乙醇开始，直到完成离心，整个操作过程控制在30s左右；倒弃收集管中废液，在无菌条件下加入600μl无菌水，反复吸打溶液使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s，重复1-2次，洗脱乙醇；倒弃收集管中废液，在无菌条件下加入600μl 0.1-0.2％氯化汞灭菌2-4min或2％次氯酸钠消毒6-8min，反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌，然后200-1200rpm离心20s；倒弃收集管中废液，在无菌条件下加入600μl无菌水，反复吸打使孢子悬浊，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s，此操作重复3-4次，使消毒液彻底洗脱；再向离心之后的吸附柱中添加600μl无菌水，反复吸打使之呈孢子悬浊液，吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上，实现接种。

一种蕨类孢子的消毒及接种方法，该方法包括下述步骤：

步骤1：收集孢子，把蕨类孢子叶片装入硫酸纸袋中，标记代号后置于通风干燥处，等孢子自由脱落；

步骤2：把DNA纯化柱，规格：吸附柱1ml，收集管2ml、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用；

步骤3：在对折过的硫酸纸片上铺一层擦镜纸，把自由脱落在硫酸纸袋中的孢子倒在擦镜纸上，轻微抖动擦镜纸进行简单的过滤，孢子可以通过擦镜纸的孔隙，而碎叶、环带、鳞毛等杂质会留在擦镜纸上达到简单过滤的目的，然后把过滤后的孢子沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中，盖好盖子，放入收集管中，做好标记，放置于离心管架上；

步骤4：在无菌操作台上，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 75％乙醇，盖好盖子消毒30s，期间倒立纯化柱1-2次，在孢子消毒的同时，吸附柱内部也得到灭菌，然后200-1200rpm离心20s，加乙醇，倒立纯化柱，离心完成尽量控制在30s内；

步骤5：取出吸附柱，倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中，放置于离心管架上。在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl无菌水，反复吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm离心20s，重复1-2次；

步骤6：取出吸附柱，倒弃收集管中废液，吸附柱放回收集管中，放置于离心管架，在无菌操作台中，打开吸附柱盖，用1ml移液枪加入600μl 0.1-0.2％氯化汞灭菌2-4min或2％次氯酸钠消毒6-8min，反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌，然后200-1200rpm离心20s；