[发明专利]硝基还原酶的特异性荧光探针及其制备和用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤缺氧程度的应用

说明书

本发明提供了硝基还原酶的特异性荧光探针及其制备和将其应用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤缺氧程度的试剂，由肿瘤生物标记物识别基团(sensor)、肿瘤靶向基团(target)、荧光基团(dye)通过化学键连接而成。该试剂基于肿瘤的缺氧性和硝基还原酶在缺氧肿瘤中的高表达，可在具有缺氧微环境，并高表达硝基还原酶的肿瘤中应用，结合荧光成像仪，可用于肿瘤靶向荧光成像，肿瘤缺氧程度监测和监测肿瘤转移等应用。该试剂在应用中实现了高灵敏度，高特异性，为医学上研究肿瘤和临床上监测、治疗肿瘤转移提供了有效的工具，因此在肿瘤靶向荧光成像，肿瘤缺氧程度监测和监测肿瘤转移等具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一类检测试剂及其制备方法和应用，具体为硝基还原酶的特异性荧光探针及其制备方法和用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤缺氧程度的应用。

背景技术

细胞的生长和增殖有赖于充分的氧气和能量供应，在供氧量正常的组织中，细胞的能量来源约90％依赖于线粒体的有氧氧化。然而，肿瘤组织内，肿瘤细胞失控性生长和增殖消耗大量的营养和氧气，其内部不能及时、有效的建立新生血管网，或新生血管网的结构和功能异常，存在暂时性封闭或“盲端”；并且通透性较高，液体外渗至组织间隙导致血流黏滞阻力增加。这些因素使肿瘤内部血流减少，氧的供应远少于氧的需求，肿瘤细胞处于缺氧状态。此外，恶性肿瘤的自身进程以及抗肿瘤治疗所造成的贫血亦加剧了肿瘤的缺氧，肿瘤内部缺氧微环境由此产生。

硝基还原酶家族属黄素酶，可以在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在下代谢芳香族硝基化合物或者硝基取代的杂环化合物。研究表明缺氧组织或细胞以及肿瘤中硝基还原酶的含量相对正常状态呈现升高趋势。在缺氧条件下以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH作为电子供体细胞内的硝基还原酶可催化多种外源硝基芳香族化合物发生单电子转移，生成硝基阴离子自由基，随后进一步被还原成羟胺或氨基。研究发现，硝基还原酶通常存在于细菌中，如大肠杆菌，在人的正常细胞中几乎不存在，而在恶性肿瘤中大量存在。因此，硝基还原酶可以作为肿瘤的生物标记物。

小分子荧光探针被广泛的应用于化学分析，生物分析以及生物动态过程实时、非侵入性监测。因此，小分子荧光探针被广泛用于药物筛选和治疗效果的评估，实现了肿瘤治疗效果的早期监测。

RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)氨基酸序列是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中常见的基本成分，也是纤维细胞黏附的主要位点。人的基因组可产生24个不同的已知的整合素，大约有1/3的整合素在不同程度上识别RGD序列。肿瘤新生血管内皮细胞膜表面表达高水平的αvβ3/α5β1和α5β1整合素，因此含有RGD序列的蛋白，作为整合素配体，能够靶向性到达肿瘤局部新生血管内皮。外源性RGD多肽及其类似物可与体内含RGD序列的物质竞争结合，从而阻断血管上皮细胞增殖的信使传递，终止细胞增殖，使血管不能生长，导致肿瘤组织供氧系统中断，最终细胞萎缩、凋亡。研究发现RGD环状多肽比线状多肽有更高的受体结合特异性。基于上述原因，大量含RGD序列的线性或环状多肽被作为αvβ3拮抗剂合成，部分已成功制成荧光探针。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于制备了一类硝基还原酶的特异性荧光探针及制备方法和应用。该探针本体和被硝基还原酶还原后的产物，荧光强度具有明显的差别，且产物荧光可由荧光检测器检测，利用该探针反应可对多种生物体系中硝基还原酶的分布和反应效率进行评价。

本发明第二个目的提供一种肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤转移的试剂。

本发明第三个目的提供所述硝基还原酶的特异性荧光探针在制备用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤转移的试剂上的应用。

本发明第四个目的提供提供一种监测肿瘤缺氧程度的试剂。

本发明第五个目的提供所述硝基还原酶的特异性荧光探针在制备用于监测肿瘤缺氧程度的试剂上的应用。

本发明的技术方案如下：