[发明专利]用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法

说明书

本发明公开了一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测，包括以下步骤：1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；2)对数据进行首次分类，3)根据首次分类的结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布；4)计算最终判决阈值t；5)利用所述判决阈值t对数据进行二次分类；6)计算样品浓度。本发明的方法对数字PCR荧光微滴荧光强度分布进行了准确描述，能够在无需阴性对照的情况下自动确定合适的阈值从而识别阳性微滴的数量，能有效提高数据分类的准确率，从而能显著提高荧光液滴检测结果的精确性。

技术领域

本发明涉及用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法技术领域，尤其是一种基于荧光液滴的核酸检测的阳性液滴自动识别方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究。数字PCR是近年来发展迅速的新一代定量PCR分析技术，利用微流控技术将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有至少一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统的荧光定量PCR相比，具有高灵敏度、高特异性、无需标准定量曲线等优点。数字PCR技术提出至今，相关技术和产业化发展都非常迅速，迄今为止，数字PCR技术主要有三类:微反应室孔板、大规模集成微流控芯片和液滴数字PCR系统。

早期的数字PCR采用96/384孔板作为反应单元，随着对测试灵敏度和准确度的要求不断提高，反应单元的数目不断增加，使得操作的复杂度和所需试剂量也成倍增加。大规模集成微流控芯片技术的出现为数字PCR分析提供了一个低成本、小体积和高通量平行分析的方案。液滴式数字PCR系统源于乳液PCR技术，通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系，比微孔板和集成微流控芯片系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

液滴微流控芯片是近年来在微流控芯片基础上发展起来的一种新的操纵微量液体的技术。与传统微通道芯片相比，微液滴的体积更小(10^-9L-10^-12L)，可灵活操控，尺寸均一，形状可变，传热传质性能优秀，并具有高通量分析的良好潜力。将液滴微流控技术应用在生化分析领域，常使用荧光标记感兴趣的细胞或分子，通过识别带荧光液滴检测样品中待测物浓度。因此准确地确定荧光阈值对最终结果具有重要影响，目前基于荧光微滴PCR核酸检测的阈值确定方法有两种，一种是使用无待测样品的阴性质控品，通过统计该质控品中微滴的最大荧光强度决定判别阈值，这种判决方法的识别准确性高，但需要参考阴性质控；另一种则基于Kmeans聚类算法，该方法无需对比，但由于荧光微滴的分布并非简单两类，而存在多种干扰，最终结果往往出现较大偏差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测中液滴的自动识别，尤其可用于液滴式样品的荧光检测中的荧光液滴的自动识别，包括以下步骤：

一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测，其特征在于，包括以下步骤：

1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；

2)对所述步骤1)中的数据进行首次分类，得到阳性液滴和阴性液滴的首次分类范围，所述首次分类的方法包括传统聚类算法或基于模型的聚类算法；