[发明专利]一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法

权利要求书

1.一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：采集成熟芦苇小穗，去内外稃，以表面无损的芦苇种子为外植体；

步骤二：将步骤一中所述的外植体消毒后，置于诱导培养基上诱导出粘性愈伤组织；

步骤三：剥取步骤二中所述的粘性愈伤组织，将所述粘性愈伤组织转置于新鲜的诱导培养基上，进一步诱导出胚性愈伤组织；

步骤四：将步骤三所述的胚性愈伤组织通过增殖培养，获取胚性培养物；

步骤五：将步骤四所述的胚性培养物转至无植物生长调节剂的再生培养基上生成完整植株；

步骤六：将步骤五中生成的完整植株进行培养，得到芦苇再生苗；

步骤七：将步骤六所述的芦苇再生苗转至无菌组培瓶中进行培养，向所述无菌组培瓶中加入无菌OECD模拟废水；采集活性污泥，将所述活性污泥离心、清洗后加入所述组培瓶中，用组培膜覆盖瓶口，将所述组培瓶于人工气候箱中孵育；

步骤八：取经步骤七处理的芦苇再生苗的根组织，将所述根组织的表面进行消毒后研磨成浆，再将所述根组织的浆标准稀释涂布于MS平板上，将所述MS平板放置在恒温培养箱中培养，待菌落长出；

步骤九：从步骤八所述的MS平板上挑选草螺菌单菌落，接种至NB液体培养基中培养；然后离心处理所述NB液体培养基以收集菌体，清洗收集的所述菌体，使用MS液体培养基重新悬浮所述菌体制成细菌重悬液，调节所述细菌重悬液中草螺菌的OD_600nm值为0.01-1；取至少一个芦苇胚性培养物浸入所述细菌重悬液中孵育，将所述芦苇胚性培养物转至无菌滤纸上除去表面菌体后，再将所述芦苇胚性培养物置于MS平板上进行培养；

步骤十：配制人工胚乳；向所述人工胚乳溶液中加入海藻酸钠，配制成溶胶悬液作为种皮基质，同时使用去离子水配制CaCl₂溶液作为络合剂，将所述溶胶悬液和CaCl₂溶液分别调节pH值后灭菌处理；

步骤十一：将步骤九所述的芦苇胚性培养物加入步骤十所述的种皮基质中，均匀混合后，再用无菌巴氏吸管每次吸入一个所述芦苇胚性培养物，滴入步骤十所述的CaCl₂溶液中，取出后将所述芦苇胚性培养物清洗晾干，即形成人工种子；

步骤十二：将步骤十一所述的人工种子放在MS培养基上进行萌发培养。

2.根据权利要求1所述的一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：所述诱导培养基的制备方法为：向每升MS液体培养基中加入1mg的二氯苯氧乙酸、1mg的萘乙酸、0.5mg的6-苄基腺嘌呤、30g的蔗糖以及0.5mg L-谷氨酰胺；所述增殖培养基的配制方法为向每升MS液体培养基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的琼脂；所述再生培养基的配置方法为：向每升MS液体培养基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的琼脂。

3.根据权利要求1所述的一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：步骤二所述的消毒为用质量浓度为5％的次氯酸钠进行表面消毒，步骤二所述的粘性愈伤组织为在胚芽鞘末端的白色、半透明、有光泽组织；步骤三所述的胚性愈伤组织为表面具有细小瘤状物和绿点的组织；步骤四所述的胚性愈伤组织通过质量浓度为2.5mg L^-1的2,4-二氯苯氧乙酸进行增殖培养。

4.根据权利要求1所述的一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：步骤六所述的完整植株的高度为5cm～10cm，培养方式为转至1/2MS液体培养基中进行水培，或以蛭石为栽培基质进行。