[发明专利]25‑羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法

说明书

技术领域：

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，包括蛋白交联技术、膜层析技术、标记免疫分析技术等。具体地说是一种能够快速准确的对血清、血浆和全血等样品中25-羟基维生素D3进行定量分析的25-羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法。

背景技术：

VD系类固醇的衍生物是促进机体钙磷吸收的主要元素，在自然界中以10 多种形式存在，维生素的两个最重要的形式是维生素D₃和维生素D₂，对动物最有营养意义。而VD在体内仅是其活性代谢物的前体，只有转化为25-羟基 D3(25-OH-D3)和1,25-二羟基D3(1,25-(OH)2D3)后才有生物活性，才能有效地发挥其生理生化功能。25-OH-D3是维生素D在体内的主要活性产物，是评价维生素D营养水平及诊断佝偻病可靠而敏感的指标。25-OH-D3的重要生理功能是调节机体Ca,P的正常代谢，维持动物血钙、血磷水平,保持骨骼的正常生长发育, 防止钙缺乏症,如软骨病、佝偻病等。在人体内，维生素D3和D2与血浆中维生素D结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经25羟基化成为25羟基维生素D，在血清中检测出来的95％以上的25羟基维生素D为25羟基维生素D3，维生素 D缺乏是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因。提高甲状旁腺激素含量，特别是提高缺乏维生素D的老年人的甲状旁腺激素含量会导致骨软化症，增加了骨转化，降低了骨质量，并有骨折的危险。25-羟基维生素D3含量低还与骨密度低有关。与其他临床数据结合，其结果可作为辅助手段来判定骨代谢。

免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。本试剂盒利用的含有稀土元素的羧基乳胶微球标记免疫分析技术是属于标记免疫分析之一种。

荧光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到FIA因自然本地太高，干扰检测结果；RIA采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的超微量时间分辨荧光免疫分析技术(Time resolved Fluoroimmunoassay，简称TrFIA)。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。

TrFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤效应等)发生后，用TrFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光(来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光)强度大、干扰强，成为荧光分析法大范围推广的瓶颈。TrFIA之所以能够成为继EIA、RIA之后一种新的灵敏的检测方法，主要取决于镧系元素独特的荧光特点、检测中采用的波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术。