[发明专利]一种大菱鲆增食欲素Orexin基因、重组蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种大菱鲆增食欲素Orexin，其特征在于：所述大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述的大菱鲆增食欲素Orexin的Orexin基因，其特征在于：所述Orexin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的Orexin基因，其特征在于：克隆所述Orexin基因所需的引物F1和R1序列如下：

F1: 5′- TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT -3′；

R1: 5′- ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA -3′。

4.含有权利要求2所述的Orexin基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-24a-SL，其制备过程为：使用正向引物F和反向引物R，通过PCR扩增获得所述Orexin基因，并在Orexin基因的两端分别添加XhoI和EcoRI酶切位点，将该核苷酸序列经过限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表达载体XhoI和Eco4RI酶切位点之间，获得重组表达载体pET-24a-orexin。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述正向引物F和反向引物R序列如下：

F:5′- CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3′；

R:5′- CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG -3′；

PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35个循环。

7.权利要求1所述的大菱鲆增食欲素Orexin重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

（1）将重组表达载体pET-24a-orexin转化大肠杆菌，将挑取的阳性克隆菌株接种于含有卡那霉素的LB液体培养瓶中，37℃振荡培养过夜，次日转接到含有LB 培养基的发酵罐中，37℃培养到OD600=0.5~1.0时，加入IPTG诱导重组蛋白表达，离心收集细菌培养物；

（2）将诱导表达后的细菌培养物重悬于裂解液中，超声破碎，将超声破碎的细胞裂解液离心，收集沉淀即为包涵体，使用包涵体洗涤液洗涤包涵体；用溶解缓冲液溶解包涵体，4℃放置过夜；室温下离心；将上述溶液滴加到缓冲液，将稀释后的包涵体溶液装入透析袋中，4℃透析过夜；

（3）利用低压层析系统，将透析后的包涵体溶液上样至Ni柱；收集洗脱后的蛋白流出液；装入透析袋中，放入缓冲液中，透析过夜；获得纯化后的增食欲素Orexin重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的大菱鲆增食欲素Orexin重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中IPTG的浓度为0.5 ~ 0.7mmol/L，诱导表达的时间为3 ~5h。

9.根据权利要求7所述的大大菱鲆增食欲素Orexin重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中透析后的包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱。