[发明专利]一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条及制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜；所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体，包被膜上含有用福莫特罗偶联载体蛋白的预包被检测线T线，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线，两条线竖直平行排列；所述底板为PVC条；所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为不透明的胶膜；所述福莫特罗单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，由CCTCC NO:C2016182的杂交瘤细胞株Formoterol-3E6产生；该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株Formoterol-3E6，于2016年10月26日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:C2016182；所述福莫特罗单克隆抗体由福莫特罗抗原产生，该福莫特罗抗原为由福莫特罗与载体蛋白采用碳化二亚胺法合成的偶联物，包括免疫原与检测原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述福莫特罗免疫原使用牛血清白蛋白为载体；所述福莫特罗检测原使用卵清蛋白为载体。

2.如权利要求1所述检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备福莫特罗抗原工作液：

(a)活化对氨基苯甲酸的制备：称取6mg亚硝酸钠，溶在0.35mL蒸馏水中，然后称取10mg对氨基苯甲酸，溶入1.1mL 1mol/L的盐酸中，冰浴搅拌，将上述亚硝酸钠溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1h，得到活化对氨基苯甲酸；

(b)带有羧基的福莫特罗活性中间体的制备：称取福莫特罗30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂缓冲溶液中，所述硼砂缓冲溶液pH＝9并且含0.15mol/L的氯化钠，冰浴搅拌，将此溶液逐滴加入到活化对氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反应3h，得到带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液；

(c)免疫原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC 140mg、NHS 60mg溶解在2mL PBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h；称取BSA 200mg溶解在1mL 0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次；透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存；标记为Formoterol-BSA；

(d)检测原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC 140mg、NHS 60mg溶解在2mL PBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h；称取OVA 150mg溶解在1mL 0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次；透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存；标记为Formoterol-OVA；

(2)制备福莫特罗单克隆抗体工作液：

(a)动物免疫：选择载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，间隔2周免疫1次，三次免疫后测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；

(b)细胞融合：取步骤(a)选定的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗福莫特罗的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(c)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性Blab/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，得福莫特罗单克隆抗体；

(3)制备胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体：

将待标记的福莫特罗单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，取胶体金溶液10mL，用0.1mol/LK₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量福莫特罗单克隆抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10g BSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mol/L的Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体，4℃保存备用；

(4)胶体金垫制备：按规格裁取玻璃纤维棉，将胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体用喷金仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；

(5)检测线和质控线的制备：将福莫特罗抗原放于喷金仪贮存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的直线式隐形检测线和隐形质控线，自然干燥，密封，4℃保存备用；

(6)试纸条组装：将样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，并在试纸条两端的表面粘贴保护膜，在切槽机上切割成试纸条。