[发明专利]一种高速三维双光子荧光成像系统及其成像方法和应用

说明书

本发明提供一种高速三维双光子荧光成像系统及其成像方法和应用，其中所述高速三维双光子荧光成像系统包括双光子显微镜、近红外飞秒激光器、X轴扫描装置、Y轴扫描装置、Z轴扫描装置和图像识别装置；所述X轴扫描装置设置为包括共振扫描镜；所述Y轴扫描装置设置为包括检流计扫描镜；所述Z轴扫描装置设置为包括高速压电扫描装置，所述高速压电扫描装置设置为通过振动物镜实现高数值孔径聚焦光斑沿Z轴方向的移动。本发明采用该系统，简单实用，通过Z轴高速扫描与X轴的共振扫描镜及Y轴的检流计扫描镜相配合，并借助两次三维成像及优化三维成像空间的方法进一步提高三维成像速度，从而解决了扫描速度过慢的问题，且避免了对声光偏转器件的使用。

技术领域

本发明涉及双光子荧光成像技术领域，尤其涉及一种高速三维双光子荧光成像系统及其成像方法和应用。

背景技术

哺乳动物大脑皮层的神经细胞通过大量的树突相互连接组成神经网络，从而形成了大脑计算功能的物质基础。近期研究表明，树突自身能够主动地产生电尖峰脉冲，故被认为具有主动处理外界输入信息的能力，使得大脑的计算能力扩大。因此，通过对树突行为的深入研究，有助于理解大脑神经回路的运行模式和信息处理机制。但是，现有的对神经细胞的研究技术在实际操作过程中存在如下问题：

1、目前，神经科学领域广泛采用的研究技术是膜片钳电生理技术，该技术采用微电极接触神经细胞，适用于记录单个神经细胞的胞体、轴突和树突的电位，具有很高的时间和空间分辨力，然而由于微电极尺寸的限制，该方法难以实现对树突棘和突触等细小功能部位的探索，同时也无法记录神经细胞群的电生理活动。

2、随着科学技术的发展，双光子荧光成像技术被广泛应用于神经科学领域的多个方面，该技术具有激发区域小，成像深度高，焦点外光漂白作用小等优势。因此，商用双光子显微镜被用于记录单个神经细胞钙离子的尖峰传播，大脑视觉皮层内的神经细胞均呈三维分布形态，而该显微镜采用二维扫描，每次只能获取单个神经细胞中某一部位的钙离子荧光浓度随时间变化的信息，如果需要测量单个神经细胞的不同树突或神经细胞群的钙离子动力学变化，只能采用分时记录的方法，无法完成同时观测需求。

3、为了系统性地了解大脑皮层神经网络互联结构，探索神经细胞钙离子的动力学现象，同时记录神经细胞群大量树突上的钙离子尖峰传播现象，一些研究组采用了Z轴焦点调制和随机扫描方法，以实现高速三维双光子荧光成像。这其中，随机扫描方法需要采用声光偏转器件，而声光偏转器件是一种强色散元件，超短激光脉冲通过声光偏转器件后无论从时间还是空间上都会产生展宽效应，因此往往需要复杂的光学补偿技术，另外，声光偏转器件本身的时间和空间分辨率相互制约，基于声光偏转器件的双光子成像技术仍然需要声光偏转器件本身性能的提高。

发明内容

本发明的主要目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种简单实用，通过Z轴高速扫描与X轴的共振扫描镜及Y轴的检流计扫描镜相配合，并借助两次三维成像及优化三维成像空间的方法进一步提高三维成像速度，从而解决了扫描速度过慢的问题，且避免了对声光偏转器件的使用的高速三维双光子荧光成像系统及其成像方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高速三维双光子荧光成像系统，其中所述高速三维双光子荧光成像系统包括双光子显微镜、近红外飞秒激光器、X轴扫描装置、Y轴扫描装置、Z轴扫描装置和图像识别装置；

所述X轴扫描装置设置为包括共振扫描镜，所述共振扫描镜用于实现所述双光子显微镜对检测样品X轴方向的扫描，且该共振扫描镜设置为电性连接所述图像识别装置；

所述Y轴扫描装置设置为包括检流计扫描镜，所述检流计扫描镜实现了检测样品Y轴方向的线性扫描，且该检流计扫描镜设置为电性连接所述图像识别装置；

所述Z轴扫描装置设置为包括高速压电扫描装置，所述高速压电扫描装置设置为通过振动物镜实现高数值孔径聚焦光斑沿Z轴方向的移动，且该高速压电扫描装置设置为电性连接所述图像识别装置，所述高速压电扫描装置用于实现Z轴方向的线性扫描；