[发明专利]用于调控靶基因表达的重组DNA构建体和方法

说明书

本发明提供重组DNA构建体和用于通过干扰小RNA和其靶基因结合来操纵由小RNA调节的靶基因表达的方法。更具体地，本发明公开了编码用于调节靶基因表达的切割阻断剂、5‑修饰的切割阻断剂和翻译抑制剂的重组DNA构建体及其使用方法。还公开了可用于设计包含miRNA‑无应答转基因、miRNA诱饵、切割阻断剂、5‑修饰切割阻断剂和翻译抑制剂的重组DNA构建体的miRNA靶标，及其使用方法，以及含有这种构建体的转基因真核细胞和生物体。

本申请是申请日为2009年7月1日、申请号为200980131696.9、发明名称为“用于调控靶基因表达的重组DNA构建体和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用以及序列表的合并

本申请要求于2008年7月1日申请的美国临时专利申请61/077,244的优先权权益，该申请以引用方式全部并入本文。在2008年6月27日创建并以电子提交方式与美国临时专利申请61/077，244一起于2008年7月1日提交的名称为“38-21_55745_A.txt”的文件中含有的序列表(用操作系统MS-Windows统计为2574千字节)以引用方式全部合并入本文。创建于2009年9月1日并且于2009年9月10日电子提交的名称为“38-21_55745_B_替换.txt”的文件中含有的序列表(用操作系统MS-Windows统计为2611千字节)以引用方式合并入本文。

技术领域

本发明公开了重组DNA构建体，所述构建体具有将加工成RNA的DNA，所述RNA为靶基因转录物提供RNA酶III切割抗性。这种RNA用作可用于调节靶基因表达的切割阻断剂和翻译抑制剂。还公开了miRNA识别位点序列及其在设计重组DNA构建体中的用途，所述重组DNA构建体包括miRNA-无应答转基因、miRNA诱饵(decoy)、切割阻断剂和翻译抑制剂。还公开了在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。还公开了利用本发明重组DNA构建体来调控靶基因表达的方法。

背景技术

已经描述了参与RNA介导的基因抑制的若干细胞途径，其各自在 特征性途径和具体组成上不同。通常，RNA介导的基因抑制包括在单个RNA分子内形成或在两个RNA分子间形成的双链RNA(dsRNA)中间体。该较长的dsRNA中间体由RNA酶III家族的核糖核酸酶(Dicer或Dicer样核糖核酸酶)加工成一条或多条小双链RNA，其中一条链由核糖核酸酶合并入RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)。认为哪条链合并入RISC中取决于双链小RNA的某种热力学特性，如Schwarz et al.(2003)Cell,115:199-208和Khvorova等(2003)Cell,115:209-216所描写的那些。

siRNA途径包括将较长双链RNA中间体非定相切割(non-phased cleavage)为小干扰RNA(“siRNA”)。认为siRNA的大小是约19至约25个碱基对，但是常见种类的siRNA包括含有21个碱基对至24个碱基对的那些。例如参见Hamilton等(2002)EMBO J.,21:4671-4679。