[发明专利]一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法。本发明提供了鸡胚胎干细胞的体外培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子和白血病抑制因子得到的培养基；所述碱性成纤维细胞生长因子、所述干细胞因子和所述白血病抑制因子在所述体外培养基的配比为1:1:1。本发明首次利用可传代的鸡胚成纤维细胞系DF‑1细胞系作为饲养层，通过外源添加人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),重组小鼠干细胞因子(mSCF)和人白血病抑制因子(hLIF)三种细胞因子，从而可以实现在体外长期、稳定培养鸡胚胎干细胞且维持其自我更新能力。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域的方法，尤其涉及一种体外长期稳定培养鸡胚胎干细胞的方法。

背景技术

近年来，胚胎干细胞在农业、医学、基础发育生物学等领域扮演着重要角色。而鸡由于生殖生理特点独特，其胚胎干细胞对转基因鸡制备，药物生产，禽类发育动物模型建立等方面意义重大。而为禽类胎发育研究提供了一个新动物模型。而如何实现在体外简便、稳定的培养鸡胚胎干细胞就成为开展这些工作的前提。目前，主要采用9N2体系和403体系体外培养鸡胚胎干细胞，这两种体系都以STO细胞(SIM小鼠胚胎成纤维细胞系)为饲养层。9N2体系需要外源添加多种细胞因子以维持鸡胚胎干细胞的多潜能性，此方法饲养成本较高；403体系则是利用布法罗大鼠干细胞分泌的因子维持胚胎干细胞增殖且不分化，此方法较为复杂且稳定性差。

发明内容

本发明一个目的是提供鸡胚胎干细胞的体外培养基。

本发明提供的鸡胚胎干细胞的体外培养基，为在基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子和白血病抑制因子得到的培养基；

所述碱性成纤维细胞生长因子、所述干细胞因子和所述白血病抑制因子在所述体外培养基的质量比为1:1:1。

上述培养基中，所述碱性成纤维细胞生长因子和所述白血病抑制因子分别为人源碱性成纤维细胞生长因子和人源白血病抑制因子；

所述干细胞因子为小鼠干细胞因子。

上述培养基中，所述碱性成纤维细胞生长因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml；

所述干细胞因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml；

所述白血病抑制因子在所述体外培养基中的终浓度为10-20ng/ml。

上述培养基中，所述基础培养基为培养动物干细胞的培养基；

或，所述基础培养基为培养动物干细胞的培养基；所述培养动物干细胞的培养基具体为培养鸡胚胎干细胞的培养基；所述培养鸡胚胎干细胞的培养基具体由高糖DMEM、浓度为2mM谷氨酰胺，浓度为1mM丙酮酸钠，浓度为0.16mMβ-巯基乙醇，浓度为100U/ml链霉素、浓度为100U/ml青霉素及质量百分含量为5％胎牛血清组成。

本发明另一个目的是提供鸡胚胎干细胞的体外培养试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述培养基和/或鸡胚成纤维细胞系。

上述试剂盒中，所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1。

本发明另一个目的是提供一种体外培养鸡胚胎干细胞的方法，包括如下步骤：在鸡胚成纤维细胞系饲养层细胞和上述培养基中培养离体鸡胚胎干细胞，得到体外培养后鸡胚胎干细胞。

上述方法中，所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1；

或所述培养时间为7天。

由上述方法制备得到的鸡胚胎干细胞。

上述鸡胚胎干细胞在分化得到脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和神经细胞中的应用也是本发明保护的范围。