[发明专利]血清miRNA‑4463作为肝细胞癌的诊断标志物的应用

说明书

技术领域

本发明涉及血清microRNA(miRNA-4463)作为肝细胞癌的诊断标志物的应用，属于生物技术和医学领域。

背景技术

原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其高居癌症相关死亡肿瘤的世界第三位。具有恶性程度高、转移率高、复发率高及生存率低的流行病学特点。严重危害人们生命健康，成为威胁人类公共卫生的巨大挑战。由于肝癌的早期临床表现隐匿和缺乏有效的早期诊断，大部分患者诊断时都为晚期肝癌，常伴有远处转移或肝内转移，其预后差，生存期短。因此早期发现和诊断对于及时采取有效的治疗手段，改善患者预后，延长生存期具有重要的意义。

甲胎蛋白(AFP)是目前使用最为广泛的诊断肝癌的肿瘤标志物，但是AFP仍存在诊断误区，例如部分肝癌患者的AFP呈阴性或轻度升高。并且在其他肝脏疾病例如肝炎、肝硬化中，AFP同样也会升高。

血清循环microRNA是一类单链，内源性非编码小分子RNA。研究表明miRNAs参与了疾病的发生发展、复发及转移。miRNA的表达紊乱是导致包括肝癌在内的一系列肿瘤形成的重要因素。miRNAs更早、更稳定的在体液或组织中表达，即使经过高温、极酸或极碱性条件下，血浆中miRNAs的含量变化不大，甚至是经过多次冻融循环，其同样能保持相对稳定。同时血清microRNA的检测方法具有无创性、非侵入性，不会增加患者的身体以及经济负担。

大量研究证实miRNAs对于包括肝癌在内的许多疾病的发生、发展、增殖及转移等多个生物学过程都起到了一定的作用。目前关于肝癌血清中循环microRNA的大量研究，也证明了其对于肝癌的诊断、转移以及预后的关系。

综上，血清microRNA是一种理想的肝癌诊断标志物。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种应用血清microRNA作为肝癌诊断标志物及预后判断的新方法。

本发明利用microRNA表达谱芯片技术，分别比较肝癌患者和正常人血清microRNA表达谱，筛选得到了表达水平具有明显差异的关键microRNA。在此基础上，利用Real-time PCR技术分别检测肝癌患者及正常人血清中关键microRNA的表达水平，随后采用SPSS 18.0软件(IBM,Chicago,IL)分析发现：肝癌患者血清中miRNA-4463的表达水平明显高于正常人。而且对于低甲胎蛋白型肝癌(AFP<400ug/l)，其miRNA-4463表达水平较正常人也明显升高。因此，miRNA-4463可以作为肝细胞癌的诊断标志物。同时对于低AFP的患者，检测miRNA-4463的表达水平，对于诊断肝癌具有更大的指导价值。

具体而言，本发明是通过以下技术方案实现的：

1.miRNA-4463作为肝细胞癌的诊断标志物或在制备肝癌诊断试剂中的用途，所述miRNA-4463的碱基序列为GAGACUGGGGUGGGGCC。

2.一种检测血清样本中miRNA-4463的表达水平的方法，该方法包括：

A、取血清样本，提取RNA；

B、以提取的RNA为模板，进行cDNA的合成；

C、使用特异性引物QIAGEN 218300-MS00044996、miR-39引物QIAGEN218300-MS00019789和上述cDNA，进行RT-PCR反应，获得待测血清标本中microRNA-4463的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；

D、根据公式(ΔCT＝CT _{miR-miRNA-4463}–CT _reference)，根据得到的CT值减去内参的CT值，得到该被检测者miRNA-4463的表达水平，

其中CT _{miR-miRNA-4463}是指肝癌患者血清标本中microRNA-4463的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CT _reference是指内参miR-39的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。