[发明专利]真菌基因定点插入突变的近原位回补方法

说明书

本发明公开了一种真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，将修饰过的互补基因片段和U6启动子驱动携带抗性基因特异识别序列的sgRNA表达盒与根癌农杆菌T‑质粒整合，构建以诺尔丝菌素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的病原真菌基因定点互补载体；用该互补载体转化病原真菌基因插入失活突变体的孢子，依赖该突变体所携带的Cas9对靶标位点进行切割，从而实现将互补基因片段准确插入突变体的抗性基因靶标序列。发明人将该法应用于甘蔗鞭黑穗菌Δmfa2、prf或g827突变株实现了互补DNA片段的准确定点插入，使目标基因功能恢复，具有简易性、高效性和准确性，为研究病原真菌功能基因组学提供了重要工具。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域中用于真菌基因敲除及互补的分子工具及实验体系，尤其涉及一种真菌基因定点插入突变的近原位回补方法。

背景技术

基因失活技术是通过改变生物的遗传基因，令特定的基因序列发生改变，导致基因失活并丧失功能，进而推测出该基因生物学功能的一种遗传工程技术。基因互补是在基因缺失突变体中人工导入所缺失的基因从而实现恢复该基因功能的技术。基因失活和基因互补广泛应用于基因功能的研究。

根癌农杆菌(Agrobac terium tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然条件下，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将其染色体外遗传物质Ti质粒段DNA(T-DNA)大多以单拷贝形式随机整合进植物的基因组中。许多研究表明根癌农杆菌不仅可以转化植物而且可以转化细菌、动物和真菌。因此，通过这一原理，利用农杆菌介导将外源DNA片段转化至靶细胞中已成为研究植物、真菌甚至动物功能基因的一种常用反向遗传学技术。

CRISPR/Cas是一种基因定点编辑技术，在该系统中通过形成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)引导核酸酶Cas9蛋白在靶位点切割双链DNA，再通过非同源末端连接进行DNA双链断裂修复，在此修复过程中可进行序列编辑或小片段缺失而造成基因序列的改变从而起到对基因的编辑或敲除。

迄今为止，在许多病原真菌中尚无法通过转化原生质体的方法进行有效的遗传操作，只能依赖农杆菌介导的转化导入外源DNA片段，而农杆菌介导的外源DNA片段转化具有随机性，无法对特定位点进行精确插入。且在基因敲除后的基因互补验证中，有的物种由于缺乏相应的基因互补技术而无法进行基因互补验证；目前在病原真菌中均采取随机插入互补基因片段的方法进行基因互补，若基因互补时互补片段随机插入在另一功能基因的DNA编码区时则会影响其他基因功能而无法达到准确恢复所敲除的基因功能来研究基因功能的目的。因此，有必要开发一套高效的定点插入基因互补技术，为研究病原真菌的基因功能及其致病机制提供便利。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，以实现互补基因DNA片段在设定的基因组位点的准确插入，使目标基因功能恢复，从而为研究病原真菌功能基因组学提供重要工具。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，是将靶标位点经过碱基更改但氨基酸序列不变的互补基因片段和U6启动子驱动携带抗性基因特异识别序列的sgRNA表达盒与根癌农杆菌T-质粒整合，构建以诺尔丝菌素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的病原真菌基因定点互补载体；用该互补载体转化病原真菌基因插入失活突变体的孢子，依赖突变体内所携带的Cas9对靶标位点进行切割，从而实现将互补基因片段准确插入突变体的抗性基因靶标位点。

上述真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，互补基因片段经In-fusion技术重组至带有携带抗性基因特异识别序列的sgRNA表达盒及gapd基因启动子驱动的诺尔丝菌素抗性基因的双元载体中，再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化携带Cas9基因的插入失活突变体的孢子，从而达到对真菌基因组的定点互补。

突变体所携带的抗性基因为潮霉素抗性基因，以及所有来源于敲除突变体所携带的作为选择标记的抗性基因。