[发明专利]一种用于凝血酶检测的纸基适体荧光传感器的构建

说明书

本发明公开了用于凝血酶检测的纸基适体荧光传感器的构建。在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案；在纸芯片工作区域生长金铂双金属降低背景荧光信号；修饰适配体1于金钯双金属上用于特异性识别目标物；通过适配体2对凝血酶的特异性结合，荧光标记物被引入到工作区域，进而通过荧光仪实现对凝血酶的检测。

技术领域

本发明涉及纸芯片技术、荧光检测技术，更具体地说是基于适配体对目标物的特异性结合特性构建了一个用于凝血酶检测的简单、灵敏的纸基荧光传感器。

背景技术

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在止血、血管生成和肿瘤生长和转移的诊断等分子生物学中有着重要作用。由于其在生物学的重要性,凝血酶的检测分析包含各种技术比如比色、表面增强拉曼光谱和表面等离子体共振等。各种基于电化学、光致电、电化学发光和其他分析的适体传感器已广泛应用于各种生物分子的检测。与传统的分子识别体系相比,寡核苷酸适配子因合成简单，便于标记，较强的稳定性，广泛的实用性等优点具有很强的竞争力。

为了提高凝血酶检测的灵敏度，贵金属复合纳米材料因其比表面积大、生物相容性好等优势在科学技术领域引起了很大的关注。长有这种贵金属复合纳米材料的纸芯片，不仅增加了纸芯片的比表面积，而且有效降低了纸的背景荧光，因而广泛应用于各种类型的生物传感器中。近几年，量子点因其制备过程简单，生物相容性好，激发光谱较宽，对称性高的发射光谱，具有抗漂白性等优点。使其被广泛地用作生物标记材料。用量子点代替有机荧光标记材料，可以大大减少成本，提高检测地灵敏度。同时选用生物相容性非常好地多孔氧化锌作为载体，大孔结构大大提高了该体系中量子点的负载量，从而进一步提高检测灵敏度。

自2007年以来，纸基传感器因其低成本，大比表面积，易折叠、处理、成型，生物相容性好等特点被应用于临床诊断的研究。我们利用纸的可折叠性将其折成理想的构象，并且利用纸纤维的毛细管现象，水可以自发流动避免了泵的引入起到真正意义上的装置简化。通过对纸芯片的合理设计和裁剪，结合适配体和凝血酶的特异性结合构建了一个简单、灵敏的纸基荧光传感器。

发明内容

本发明的目的是充分利用纸的可折叠性和毛细管现象及AuPt合金纳米粒子的优良性能制备一种新型的纸基荧光分析器件，并结合适配体的特异性识别功能实现方便快捷地高灵敏检测凝血酶。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：

（1）在计算机上设计如附图1所示的纸芯片疏水蜡打印图案；

（2）将步骤（1）中设计的打印图案通过蜡打印机打印在已裁剪为A4大小的色谱纸上，然后将带有蜡图案的A4色谱纸通过加热到125ºC的平板加热器加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

（3）在步骤（2）中得到的色谱纸的工作区域进行功能化，生长AuPt双金属后进行适配体1的修饰，滴加50μL待检测的凝血酶，反应45 min后用磷酸缓冲溶液清洗后用牛血清白蛋白封锁非活性位点；

（4）在步骤（2）中得到的色谱纸的孵化区域滴40μL合成好的QDs@ZnO荧光标记物和60μL的1 µM适配体2，进行荧光标记和适配体2的反应；

（5）将纸芯片沿着折叠线折叠，连有适配体2的荧光标记物QDs@ZnO在纸纤维的毛细作用力下通过流体到达工作区域，反应30 min后用磷酸缓冲溶液洗涤：

（6）将步骤（5）中纸芯片工作区放入荧光设备中，在340 nm的激发波长下进行荧光测定，绘制荧光强度与凝血酶的浓度关系，实现对凝血酶的精确检测。