[发明专利]一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法

说明书

本发明公开了一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的方法主要包括以下步骤：(1)多肽的分离纯化：将水解胶原蛋白粉通过溶解、搅拌、离心、超滤浓缩，再用离子交换层析复溶，通过凝胶色谱柱，洗脱，浓缩、干燥，得到分离纯化的多肽；(2)多肽含量测定：将分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，进行透光率检测，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；(3)多肽分子量测定：采用标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，利用粉样品检测结果与标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。本发明的测定方法设计合理，科学严密，易于操作，准确性高。

技术领域

本发明属于多肽分子量测定技术领域，具体来讲是一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法。

背景技术

多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物，由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。在高二选修有机化学基础中有对多肽的明确定义。

一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九,根据肽中氨基酸的数量的不同,肽有多种不同的称呼：由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。通常由10-100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000Da(Dalton，道尔顿)，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质,换言之,蛋白质有时也被称为多肽。多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。

分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法。常用的方法为凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小；蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷的多少，迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。然后以上方法对多肽分子量的测定过程复杂，影响因素较多，因此能快速的测定多肽分子量且能得到准确的结果是目前科研工作者研究的难题之一。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法。

本发明的技术方案如下：一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的测定方法主要包括以下步骤：

(1)将水解胶原蛋白粉和超纯水按照1:5的体积比混合，搅拌30min，然后在5-10℃下，10000～12000r/min条件下离心1h，取出上清液，将上清液使用UF膜进行超滤浓缩，浓缩前后的体积比为5:1-2，将超滤浓缩后的粉浓缩液通过使用缓冲液经离子交换层析进行复溶，得到的复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，以0.3-0.5mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，洗脱，在5-10℃下收集洗脱液在真空环境下浓缩，浓缩前后体积比为5:1，然后进行喷雾干燥，得到分离纯化的多肽，备用；