[发明专利]具有提升的酶活性的植酸酶

说明书

本发明涉及一种具有提升的酶活性的植酸酶。具体而言，本发明涉及一种具有提升的酶活性的植酸酶，其氨基酸序列为将SEQ ID NO.2的第90个位置的缬氨酸突变为苏氨酸的氨基酸序列。

本申请是申请号为201310315250.X，申请日为2013年7月24日，发明名称为“具有提升的酶活性的植酸酶”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本申请涉及一种植酸酶，尤指一种具有提升的酶活性的植酸酶。

现有技术

植酸(phytic acid)又称为肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，为植物中储存磷的主要形式，在种子中含量尤其丰富，而种子如谷类及豆类是动物饲料的主要原料。虽然种子中的植酸可成为饲养动物所需磷的重要来源，但只有反刍动物才能代谢植酸以利用其中的磷；对于非反刍动物，不能被消化代谢的植酸反而被视为抗营养物质。而植酸被视为抗营养物质的原因是植酸带有丰富的负电，易与带有正电的离子，如钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铜离子、铁离子螯合，再进一步与蛋白质及淀粉形成复合物，此复合物不仅阻碍金属离子的消化吸收，也影响消化酶作用而阻碍营养物质吸收。

无法代谢植酸的非反刍动物需在饮食中添加无机磷或添加植酸酶(phytase)。以添加无机磷的方式，不仅成本高，无法消除抗营养反应，动物排泄物中未被代谢的植酸还会造成水质污染，破坏生态平衡。而经由植酸酶在饲料中的添加，则可降低磷酸的抗营养现象提高营养吸收，增加动物对饲料中磷的可利用性达到60％之外，还能降低磷的排出达50％。

植酸酶是能够从植酸中水解出磷酸根的酶泛称，在动物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在。植酸酶能够将植酸上的六个磷酸根依序水解出来，不同植酸酶的水解最终程度不一，水解机制也不同，若依此做为分类，植酸酶可分为组氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phophatase)、紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase)、β螺旋桨植酸酶(β-propeller phytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteine phytase)，其中组氨酸酸性磷酸酶因为其最适pH值及作用条件较适合用于饲料添加，因此被广泛的研究。组氨酸酸性磷酸酶催化机制是藉由酸碱反应，将连接肌醇环及磷酸根的磷酸单酯键进行水解作用，释放出磷酸根，其水解步骤分为两个阶段，首先组氨酸酸性磷酸酶会利用活性区的组氨酸攻击植酸中的一个磷酸单酯键，形成磷酸-组氨酸中间体，再由活性区的天冬氨酸利用一个水分子提供质子给磷酸-组氨酸中间体中磷酸根的氧离子，释放出一个磷酸根。

尽管于饲料中添加植酸酶在动物饲养上已显示可增加生产力，且使用500-1000单位活性的植酸酶可代替1克的无机磷添加及减少30-50％磷的排出，但在工业上如何使占有饲料市场60％的植酸酶能具有经济效益，为酶改造持续的目标及需求。植酸酶在饲料工业的制程及应用上，必须符合以下特性：最适酸碱值为pH 2-6.5、抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性、产品制粒时的耐热性、产品具有高活性；符合以上条件才能有效降低生产成本，应用于工业上。

适合工业用的酶的取得可由自然界的生物筛选而来，但需要耗费大量时间及人力，往往获得的酶也不符合工业应用条件，需要再加以改造，而运用现有的酶再加以加强改造为较经济的方式。酶改造的策略可分为两种，一是利用定向进化，一是利用理论性的设计。定向进化包括两个步骤，一是制造具有丰富多样性的突变基因库，其次再从基因库中筛选具有特定优化特性的突变株。突变基因库的制造方法常用的有易错聚合酶链式反应(error-prone PCR)及DNA重组反应(DNA shuffling)，但庞大的突变基因库需要有大量筛选的方法，否则对于筛选上是相当耗费人力及时间的。近年来，随着可利用的蛋白质结构及序列增加，还有计算机计算软件技术的发展，可识别出蛋白质中与底物结合、活性区域、稳定结构的氨基酸，因此以此理论基础建立的有限突变基因库能更有效地筛选出优化的酶特性。

因此，本申请欲藉由植酸酶的序列比对及结构分析，对一些特定的氨基酸进行基因突变，进而有效提升植酸酶在工业上应用的产业价值。