[发明专利]从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法

说明书

本发明提供一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法，以含有抗CD20单克隆抗体的转基因哺乳动物乳样为原料，通过预处理得到脱脂乳，再将所获得的脱脂乳进行亲和色谱或复合型阳离子交换色谱分离，去除大部分杂蛋白，得到高纯度的抗CD20单克隆抗体，并将其进行病毒灭活，缓冲液置换，进一步通过复合型阴离子交换色谱纯化抗CD20单克隆抗体并将其浓缩脱盐。本发明利用色谱技术两步纯化将原乳样中抗CD20单克隆抗体分离并将杂质完全去除，达到注射药用级别，该工艺简便、快速、低成本、适合大规模生产抗CD20单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及重组蛋白纯化技术，具体地说，涉及一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法。

背景技术

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)是最常见的血液系统恶性肿瘤，绝大多数NHL发生与B细胞相关，每年预计有近300000人死于NHL，NHL是威胁人类生命的10大恶性肿瘤之一。目前，一些单克隆抗体已经成功应用于患有肿瘤的病人的治疗。美罗华(Rituximab)C2B8是美国基因生物科技有限公司研发的以人CD20分子为靶点的人鼠嵌合型IgG1免疫球蛋白，它是由人IgG1的恒定区与鼠源Kappa轻链区组成，其结构中含有1328个氨基酸残基，分子量约为144kDa，主要功能为补体依赖性细胞毒性反应、抗体依赖性细胞毒性反应和诱导细胞凋亡。1997年，通过FDA批准，美罗华上市后已经成功地治疗370000名NHL患者。

目前，分离纯化抗CD20单克隆抗体最主要的方法是液相色谱法。亲和、离子交换和疏水互作等液相色谱法的组合在单抗的实验室规模与工业生产规模中应用较多，其中包括在层析纯化过程中去除杂质的步骤，使其达到注射级药品标准。US4801687公开了将抗体溶液与盐溶液混合后使用蛋白A进行亲和层析以提高蛋白收率；中国专利号CN102179237A公开了一种由单分散多孔微球固相载体与蛋白A连接组成，从而得到亲和色谱填料，此方法用于单抗药物的生产过程以及抗体球蛋白的分离纯化；US5726293公开了一种使用咪唑作为洗脱缓冲液可以在高pH值条件下洗脱单抗，使得单抗免失生物活性；WO2005016968公开了在低温或缓冲液中加入金属离子络合剂和非离子型表面活性剂可降低亲和层析中脱落的蛋白A的含量；WO1998024485公开了在单抗溶液中加入辛酸钠孵育抗体可达到病毒灭活的作用；WO2011049798公开了一种利用复合型色谱作为第一步捕获单抗的方法；WO2014207763公开了通过亲和、疏水互作与离子交换色谱相结合的方法分离纯化单抗，即可得到蛋白纯度大于99％的单抗纯品。然而，上述方法步骤繁琐、工艺成本高，不适于工业放大。

发明内容

本发明的目的是提供一种从含有抗CD20单克隆抗体的乳样中，快速、高效分离纯化具有生物活性的且符合注射药用级别的抗CD20单克隆抗体。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法，以含有抗CD20单克隆抗体的转基因哺乳动物乳样为原料，通过预处理得到脱脂乳，再将所获得的脱脂乳进行亲和色谱或复合型阳离子交换色谱(阳离子交换色谱)分离，去除大部分杂蛋白，得到高纯度的抗CD20单克隆抗体，并将其进行病毒灭活，缓冲液置换，进一步通过复合型阴离子交换色谱精细纯化抗CD20单克隆抗体并将其浓缩脱盐。

前述的方法，所述预处理为通过蝶式离心机进行脱脂，再利用0.14μm-1.4μm滤膜进行过滤除菌，得到脱脂乳。

前述的方法，所述亲和色谱的具体步骤包括：将脱脂乳上样到电导率为2-40ms/cm，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液平衡的亲和层析柱，流速为266-399cm/h，上样完毕继续用电导率为2-40ms/cm，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液冲洗至基线，然后用电导率为10-20ms/cm，pH4.5-5.0的柠檬酸盐缓冲液洗脱乳样内源杂蛋白，最后用电导率为35-50ms/cm，pH3.0-4.0的洗脱缓冲液洗脱抗CD20单克隆抗体。