[发明专利]在CHO细胞中rhIL-12表达系统的构建方法

说明书

本发明提供了一种改造后的重组人白细胞介素‑12（rhIL‑12）基因，同时发现了一种在CHO细胞中rhIL‑12表达系统的构建方法。该方法利用基因工程手段，人工合成表达重组人白细胞介素‑12的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，并得到一种高效表达rhIL‑12真核细胞株。

技术领域：本发明涉及一种重组蛋白的制备领域，具体公开了一种在CHO细胞中rhIL-12表达系统的构建方法。

背景技术：

白细胞介素(interleukin，IL)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。

白细胞介素-12(以下简称IL-12)，由抗原提呈细胞和B细胞产生，是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。IL-12能诱导IFN-γ产生，在体内免疫应答中(特别是在细菌或寄生虫感染中)它也是IFN-γ产生所必需。IL-12是一由p35和p40(IL-12β)两条链组成的异源二聚体，两个亚单位通过二硫键连接在一起，这种结构在已发现的IL中所罕见。通常情况下，p40的量远超出p70，在鼠中已观察到p40同源二聚体的产生，是由转染的细胞分泌的，p40同源二聚体没有生物学活性，但它能和IL-12Rβ结合，与p70竞争性争夺IL-12受体(IL-12R)而拮抗其生物学作用。单独的p35不具有生物学活性，但却是合成p70的限速因子。

根据p35，p40两个亚基表达效率不同，前人研究CN200610123433.1曾将p35，p40基因插入不同效率表达载体来解决这个技术问题。然而其操作复杂，转化率低，表达不稳定，影响了其在工业上的应用。因此目前亟需获得一种操作简单，转化率高，表达稳定的载体来制备rhIL-12。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容：

本发明是利用同源性不低于95％的人白细胞介素12的p35亚基和p40亚基的人工设计核苷酸编码序列，利用基因工程的方法，人工合成表达人源重组白细胞介素IL-12的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，表达得到p35和p40两条链组成的异源二聚体，两个亚单位通过二硫键连接在一起，该异源二聚体有生物学活性；并得到一种高效表达人IL-12真核细胞株。

发明的技术方案为：

本发明提供了一种改造过的重组人白细胞介素-12基因，其特征在于：经过优化的p35亚基的编码序列如SEQ ID NO.1所示；经过优化的p40亚基的编码序列如SEQ ID NO.2所示。该基因表达的rhIL-12蛋白不仅生物活性高于野生型，其在pcDNA3.1(+)质粒和CHO细胞中表达量也要更大。

本发明还提供一种重组人白细胞介素-12的真核表达载体，其特征在于：将如权利要求1所述的两段基因装载到该表达载体上。该载体可以为pcDNA3.1(+)质粒(pcDNA3.1(+)质粒标准图谱见图1所示)，也可以为pcDNA3.1(+)质粒(pcDNA3.1(+)质粒标准图谱见图2所示)。将目的基因装载到表达载体的方法为本领域常规技术。例如，如要将SEQ ID NO.1，SEQID NO.2连接到pcDNA3.1(+)质粒上，用限制性内切酶Kpn I和Not I对合成的SEQ ID NO.1基因及pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切，用连接酶将二者连接。用限制性内切酶Kpn I和Xho I对合成的SEQ ID NO.2基因及pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切，用连接酶将二者连接。

优选的，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2基因序列分别由各自的带有SV40增强子元件的CMV启动子控制。一种可行的方式是，在合成目的基因时，将带有SV40增强子元件的CMV启动子这一段基因与目的基因合成在一条链上。如合成SV40增强子-CMV启动子-SEQ ID NO.1或SV40增强子-CMV启动子-SEQ ID NO.2这样一段基因。