[发明专利]一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法。

背景技术

现有的工业化基因合成技术与平台中必不可少的测序验证步骤都是基于一代测序的平台，即AB公司的3730测序仪平台，其原理是基于Sanger测序法基础之上，由于一代测序平台是对每一个单克隆进行验证测序，所以确定性极高。但是该测序平台的通量较低，即每次测96个样本，总体运行时间大于24小时，成本较高，即每个测序样本的市场价是15-18人民币，并且需要对送测序的每一个克隆进行质粒抽提后测序或者直接用菌液进行扩增测序，步骤繁琐，因此二代测序技术被开发使用。

现有的工业化基因合成方法大致有7个模块化步骤，分别为PCR扩增、连接转化、挑取单克隆摇菌、菌液PCR鉴定、质粒抽提、Sanger测序、PCR扩增正确克隆，最终得到的是与预期一致的约700-1500bp的PCR产物片段。该方法步骤繁多、通量低，整体流程的运行时间超过72小时，成本高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、通量高，成本低的基于二代测序技术的工业化基因合成方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法，该方法包括如下步骤：

步骤（1）、将待合成的序列拆分成多段小片段，然后用首尾合成引物合成拆分的多段小片段；

步骤（2）、采用5’端含有20个随机碱基的扩增用上下游引物对步骤（1）合成的小片段进行扩增，以便为小片段加上随机标签序列；

步骤（3）、将步骤（2）扩增后的所有小片段混合，然后采用二代测序技术进行测序，将测序结果进行对比分析，找到与预期完全一致的序列，从而确定该序列两端的随机序列为所需序列，然后根据所需序列设计调取引物；

步骤（4）、采用步骤（3）设计的调取引物对步骤（2）扩增后的小片段进行第一轮调取扩增，然后用步骤（1）中的首尾合成引物进行第二轮调取扩增，然后将第二轮调取扩增后的片段进行组装即得序列产物。

优选地，步骤（1）中待合成的序列超过100Kb。

优选地，步骤（1）中每段小片段不超过250bp。

优选地，步骤（1）中合成的小片段直接进行步骤（2），无需进行凝胶电泳检测后的切胶回收。

优选地，步骤（2）对小片段进行扩增后，进行凝胶电泳检测后的切胶回收，然后进行步骤（3）。

优选地，步骤（3）中，二代测序技术采用Illumina公司二代测序平台Miniseq仪器。

优选地，步骤（3）中，进行混合的小片段中每个片段的量为0.8~1.2ng。

优选地，步骤（3）中，进行测序时的数据量为5Gb以上，测序时间为22小时。

优选地，步骤（4）中，采用PCR进行组装或采用多段重复酶进行组装。

由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明采用了Illumina公司Miniseq二代测序平台的并行测序技术，优化了工业化基因合成中需要克隆、筛选、质粒制备后测序的步骤，代之以PCR产物测序后调取扩增随后组装的流程，使得其在不损失时间成本的情况下，工业化基因合成步骤由原来的7步简化至4步、通量由原来的96孔增加至103以上、成本由原来的15-18人民币降低至10元以下，并且还有优化空间。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得。本发明中序列的合成、引物的设计均采用本领域的常规方法进行。