[发明专利]BrdU标记免疫荧光检测细胞增殖的改良方法

说明书

本发明公开了一种免疫荧光检测BrdU标记增殖细胞的改良方法。将变性温度固定在4℃，复性统一采用0.01M Tris‑HCL处理，之后进行单标、双标及三标染色，并与常规方法进行比较。结果显示本发明方法具有非常好的染色效果，成功率高，重复性好，操作简单且节约实验时间。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及免疫荧光检测BrdU标记增殖细胞的改良方法。

背景技术

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)是人工合成的胸腺嘧啶类似物，在DNA合成期(S期)，BrdU能够代替胸腺嘧啶而渗入正在复制的DNA分子中，而组织细胞内无内源性BrdU存在。细胞培养或活体注射加入BrdU，之后采用免疫荧光染色，BrdU阳性细胞即为增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可定性、定量检测增殖细胞的种类、增殖速度及增值细胞的分化、迁移和存活，对细胞动力学的研究有重要意义。BrdU标记免疫荧光检测细胞增值的方法被广泛用于各种细胞增殖的研究。

目前BrdU标记免疫荧光检测细胞增殖的染色方法多种多样，无统一步骤。下面是两种常用的染色方法的步骤。

第一种染色方法步骤如下：

a、破膜：取组织切片，加0.4％triton室温下反应20分钟；

b、修复：经过步骤a处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，用0.01mmlol/L枸橼酸盐进行微波热修复，大火5分钟，小火20分钟，待自然冷却约1h；

c、变性：经过步骤b处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，加2MHCL于37℃下作用30分钟；

d、复性：经过步骤c处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，然后加0.01M Tris-HCL室温下反应10分钟；

e、封闭：经过步骤d处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，山羊血清封闭2小时；

f、孵一抗：经过步骤e处理后的组织切片甩掉多余山羊血清，不洗，加BrdU与其双标抗体4℃孵育过夜；

g、孵二抗：经过步骤f处理后的组织切片37℃复温1小时，加二抗37℃孵育1小时；

h、复核：经过步骤g处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，DAPI复染胞核5-8分钟；

i、封片：经过步骤h处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，甘油封片。

第二种染色方法步骤如下：

a、变性：取组织切片，加1M HCL于冰上孵育10分钟，然后加2M HCL于室温下孵育10分钟，再于37℃下作用20分钟；

b、复性：经过步骤a处理后的组织切片加0.1M硼酸缓冲液室温下中和10分钟；

c、破膜：取组织切片，加0.4％triton室温下反应20分钟；

d、修复：经过步骤a处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，用0.01mmlol/L枸橼酸盐进行微波热修复，大火5分钟，小火20分钟，待自然冷却约1h；

e、封闭：经过步骤d处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，山羊血清封闭2小时；

f、孵一抗：经过步骤e处理后的组织切片甩掉多余山羊血清，不洗，加BrdU与其双标抗体4℃孵育过夜；

g、孵二抗：经过步骤f处理后的组织切片37℃复温1小时，加二抗37℃孵育1小时；

h、复核：经过步骤g处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，DAPI复染胞核5-8分钟；

i、封片：经过步骤h处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，甘油封片。以上两种方法为目前常用的免疫荧光染色方法，具有以下几方面不足：