[发明专利]细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用。

背景技术

细粒棘球蚴病又称囊性包虫病，是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的中绦期幼虫引起的一种人兽共患病，主要寄生在人和家畜等多种哺乳动物体内。90％以上的细粒棘球蚴包囊生长于宿主的肝脏、肺脏或者同时生长于肝肺。细粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的经济和公共卫生问题。在一些流行地区，其感染率可高达5-10％，死亡率高达2-4％。据估计，全球人囊性棘球蚴病每年至少损失1-3.6百万伤残调整生命年(DALYs)，而动物囊性棘球蚴病每年造成的经济损失至少为20亿美元。因此，世界卫生组织已经把棘球蚴病列为《被忽视的热带疾病》，作为其2008-2015年重点防治计划。

缺乏标准有效的特异性重组抗原是细粒棘球蚴病免疫诊断中的一个尚未解决的难题。目前，细粒棘球蚴病免疫诊断的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分复杂，具有难以大量提纯、抗原来源不稳定、成本高、诊断特异性低等缺陷。与囊液抗原相比，重组抗原具有特异性好以及来源稳定等优点。目前，动物细粒棘球蚴病的重组诊断抗原的报道还很少，刘红霞等用细粒棘球蚴CE18重组蛋白检测绵羊细粒棘球蚴病，发现其他带科绦虫病阳性血清如羊脑多头蚴病血清和羊细颈囊尾蚴病血清均存在交叉反应，特别是和羊细颈囊尾蚴病血清的交叉反应概率较高，不能准确诊断绵羊细粒棘球蚴病。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用，使其能够能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，并具有较高的特异性和灵敏度，减少与其他带科绦虫病阳性血清的交叉反应。

二氢叶酸还原酶(DHFR)能催化二氢叶酸生成四氢叶酸，进而合成四氢叶酸类辅酶，参与体内核酸和氨基酸的合成，在生物体中发挥重要作用。二氢叶酸还原酶抑制剂能选择性的与二氢叶酸还原酶结合，抑制其催化还原活性，使二氢叶酸不能顺利转变为四氢叶酸，阻碍叶酸代谢，干扰DNA和蛋白质的合成，最终导致细胞死亡，所以二氢叶酸还原酶抑制剂具有抗癌以及抗寄生虫的作用。

DHFR在原虫上研究的比较广泛，如疟原虫、利什曼原虫、锥虫、弓形虫等，但在蠕虫上并未见相关研究，因此，本发明对细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶(Eg-DHFR)进行了生物信息学分析，并通过反转录表达出rEg-DHFR蛋白，制备出抗rEg-DHFR的多克隆抗体，对该蛋白进行免疫印迹分析表明其可被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，利用rEg-DHFR蛋白建立细粒棘球蚴病间接ELISA诊断方法，为细粒棘球蚴病的防控提供监测手段。

因此，本发明提出了细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用。

其中，作为优选，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。

同时，本发明还提供了一种检测细粒棘球蚴病的ELISA检测试剂盒，包括细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶(作为抗原进行包被)和ELISA检测试剂盒常规组分。所述试剂盒依据间接ELISA检测原理。

作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。

进一步优选地，所述封闭液为5％脱脂奶粉；所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗。

在具体的ELISA检测过程中，抗原包被的最佳条件是4℃过夜，抗原最佳浓度为0.6μg/每孔，血清最佳稀释浓度为1:320，最佳封闭液和封闭条件是5％脱脂奶粉37℃封闭1h，血清孵育最佳时间是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳时间是37℃ 1h，二抗最佳稀释浓度为1:3000时，底物显色的最佳条件是37℃15min。在以上条件下，测得阴阳性血清的P/N值为3.86。

作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液H₂SO₄、洗涤液PBST和稀释液PBS。