[发明专利]一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统

说明书

技术领域

本发明涉及光学仪器领域、生物医学显微成像领域，具体涉及一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统。

背景技术

目前在生物医药领域的研究对分辨率的要求越来越高，研究人员需要了解各种亚百纳米尺度上微小形态物质的三维结构信息，然而传统光学显微镜无法达到这样的分辨率，特别是在光轴方向上的分辨能力远远不足。电镜和原子力显微镜虽然可以提供更高的分辨率，但是只能局限于提供表面图像，无法对深层组织和活细胞进行成像，而4Pi共聚焦系统的出现完美地解决了这个问题。根据瑞利数据，增加物镜的数值孔径，可以减小点扩散函数的尺寸，从而提高显微镜的分辨率。4Pi显微镜正基于此原理，利用通过样品前后的双物镜，使显微镜总的立体接收角接近4Pi，从而提高数值孔径，提高显微镜分辨率特别是轴向分辨率。通常4Pi显微镜基于宽场或共聚焦显微镜平台，采用两个相对的相同物镜，可将轴向分辨率大幅提升，获得极佳的三维效果，因此在亚细胞结构、细胞内寄生虫和病毒等的观察方面具有广泛的应用。

对于显微镜而言，必须保证其工作的时候，物镜聚焦于样品表面。作为一套自动化仪器，具备焦平面锁定功能的显微镜，可以很好的保证系统的位相关系，为显微镜使用者获得高质量图片提供极大的便利。作为一种干涉系统，在4Pi架构的显微系统中，必须同时保证两个相对的物镜均聚焦在样品上相同位置。因此，两个显微镜头与样品相对位置锁定系统对于4Pi架构的显微系统而言显得更为关键。而与一般单镜头相比，4Pi架构的显微系统对于机械振动、热膨胀等因素更为敏感，焦平面锁定功能是一般4Pi架构显微系统的必要组成部分。 Roman Schmidt等人在《自然》杂志中发表的题为《Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells》的论文中，应用了经典4Pi架构的显微系统，采用两套独立的锁定系统分别锁定两个镜头与样品间的相对位置。这种设计可以充分借鉴单镜头显微系统的已有成果，提高设计效率，但是，该种设计方案的最大问题在于：无法保证两个镜头间相对位置的稳定。当镜头位置偏移量较大(横向偏移大于100纳米，轴向大于300纳米)时，可以在系统图像中观察到“重影”现象。这种重影现象原理上可以通过后期图像处理算法，如自相关算法等加以矫正。但在现实中，由于上下镜头单独成像图像不可避免存在微小差异，后期图像处理本身即有可能导致图像失真等严重问题。对于基于4Pi架构的超分辨显微系统，如4Pi单分子定位显微系统(4Pi-SMS)而言，由于其自身设计分辨率较高(<50纳米)，并且在原理上依赖荧光干涉实现对于单分子的定位，对于镜头位置的相对偏移的容忍度更低(横向偏移小于20纳米，轴向小于50纳米)。因此，现有的锁定系统设计并不能满足4Pi显微架构显微镜的需要。

发明内容

本发明针对现有4Pi显微系统中无法保证两个镜头相对位置、精度较低，以及后期图片处理易失真等诸多问题，提出了一种新型的基于4Pi架构的显微镜头与样品锁定系统。该结构高效、精确，可以同时实现对4Pi显微镜系统中双镜头相对位置的实时调节。

一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，包括激光器、第一透镜、第一偏振分束镜、第二偏振分束镜、第一二色镜、上显微镜头、样品台、下显微镜头、第二二色镜、第二透镜、柱面镜、第一CMOS照相机、偏心孔径光阑、第一反射镜、第三透镜、第二反射镜、第二CMOS照相机；

所述激光器发射的光束经过第一透镜的扩束准直后，发射至第一偏振分束镜：

光束中垂直偏振分量继续沿原方向传输，经过第二偏振分束镜出 射后被第一二色镜反射进入上显微镜头，被上显微镜头汇聚到样品面；从样品下表面出射后，被下显微镜头收集，之后被第二二色镜反射，经过第二透镜、柱面镜后被第一CMOS相机收集并成像；

光束中水平偏振分量被反射，经过偏心孔径光阑后，形成细光束，之后被第一反射镜反射，经第三透镜会聚到第二反射镜表面，第二反射镜反射后，进入第二偏振分束镜后再次被反射至第一二色镜表面；经过第一二色镜反射后，进入上显微镜头，会聚入射在样品表面，然后由于入射角较大，被样品表面反射回上显微镜头，再次经过第一二色镜后，被第二偏振分束镜反射到第二反射镜表面；之后通过第三透镜形成平行光束，被第二CMOS相机收集并成像；