[发明专利]一种树突状细胞的促成熟方法及其用途

说明书

本发明提供一种树突状细胞的促成熟方法及其用途。具体而言，本发明提供一种用于刺激树突状细胞的组合物，该组合物含有poly(I:C)、R848、IFN‑γ和ATP中的至少2种、至少3种或全部4种。本发明还提供含该组合物的培养液，及使用该组合物刺激树突状细胞或使用该培养液培养树突状细胞的方法。通过本发明获得的成熟DC，能高水平表达CD80、CD86及CD83表面分子标记，同时能够高水平分泌的IL‑12，有助于提高DC更有效地诱导肿瘤特异性T细胞的活化，从而提高癌症治疗效果。

技术领域

本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫学领域，涉及一种人类树突状细胞的促成熟方法及其用途。

背景技术

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前被广泛认可的抗原递呈功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)。通过识别肿瘤细胞的抗原，增强肿瘤细胞的免疫原性而有效避免免疫逃逸。DC通过受体配体的方式摄取外源性抗原，加工处理后，可分别与抗原表面表达的MHC限制性分子结合，分化为成熟DC，同时刺激初始T细胞方向特异性的活化为CD8+T细胞或CD4+T细胞，成熟DC具有很强的诱导初始T细胞活化，进而激活免疫应答的功能，是固有免疫中巨噬细胞和适应性免疫中B细胞功能的100～1000倍。此外，DC还可以激活体液免疫应答，通过不同的方式刺激B细胞活化、增殖发挥免疫效应。

目前应用于肿瘤的免疫细胞治疗有：免疫检查点单抗治疗，包括CTLA-4单抗与PD-1/PDL1单抗、DC-CIK/CTL细胞治疗与CAR-T细胞治疗。CTL通过细胞表面的TCR识别抗原表面的MHC-I类分子而结合特异性抗原，发挥短期内持久的，快速免疫应答以杀灭肿瘤细胞，因此以CTL为效应细胞的细胞免疫是抗肿瘤的主要方式，而CTL的活化需要足够数量、高度成熟的DC，方可向初始T细胞有效提呈抗原，并诱导其活化。

然而，经过长期的免疫编辑过程，恶性肿瘤尤其是中晚期恶性肿瘤患者DC功能弱化，导致肿瘤临床治疗所需DC成熟度难以达到足够水平。未成熟的DC由于功能缺陷，DC表面表型的表达和IL-12分泌量较低，无法将抗原肽有效提呈给免疫细胞。因此，有必要对DC的促成熟培养方案进行完善，才能有效的诱导免疫应答，发挥临床疗效。

Toll样受体是果蝇Toll受体的同源物，可存在于不同细胞的细胞表面和细胞内，通过识别并结合病原体相关分子模式，可刺激产生不同类型的免疫应答并发生协同作用，起到将天然免疫和适应性免疫应答联系在一起的作用。目前已经确定的人类Toll样受体家族成员有13个(TLR1-13)。它们分布于不同的免疫细胞表面或细胞内。

TLR3的配体可作为免疫佐剂，有刺激DC成熟的作用。Poly(I:C)〔聚肌苷酸胞苷酸〕是一种人工合成的干扰素诱生剂，是Toll样受体3的配体。Poly(I:C)与许多疫苗联合应用时可显著增强疫苗的免疫原性，促进DC的成熟，上调表达HLA-DR、CD80、CD86、CD83，从而递呈肿瘤抗原，激活CTL发挥免疫应答。

TLR7、TLR8和TLR9高度同源，与其他TLR不同，它们在细胞内涵体中起作用，吞噬和包膜溶解后结合它们的配体，可识别微生物的核酸。R848〔瑞喹莫德〕是TLR7/8的激动剂，在体外可诱导DC细胞分泌TNF-a和IL-12，增强DC细胞的抗原提呈功能。

TLR9可识别细菌的CpG-DNA，激活B细胞和APC的免疫刺激特性。腺病毒(adenovirus，Ad)是TLR9的配体，可直接刺激DC成熟。同时Ad是目前较好的一种将外源基因导入细胞内的方式，可在不损伤DC活性和免疫功能的情况下，较容易达到50-90％的转染率，且Ad不整合在宿主细胞基因中，因此整合突变致癌可能性小，基因毒性低。临床应用的DC均需负载与肿瘤相关的多抗原，负载肿瘤相关抗原的成熟DC比未成熟的DC具有更强的刺激T淋巴细胞产生特异抗肿瘤免疫应答。目前多利用Ad修饰多抗原后转染入DC细胞中，可使更多抗原进入DC，增强抗原的免疫原性；避免了完整菌体中一些病原性抗原对免疫效果的影响；同时Ad作为TLR9的配体可发挥免疫佐剂的作用促进DC成熟。