[发明专利]一种靶向EGFR和CD47双特异性融合蛋白、制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种新型靶向EGFR和CD47的双特异性抗体融合蛋白、制备方法及其应用。本发明所提供的一种新型双特异性抗体融合蛋白Bi‑SP具有同时结合EGFR和CD47的功能，该双特异性抗体融合蛋白在结合EGFR的同时，也可封闭或阻止CD47和SIRPα结合，将重新激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应，起到更好的抗肿瘤作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型靶向EGFR和CD47的双特异性抗体融合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜受体酪氨酸激酶，在肿瘤进展中有着重要作用。过度的EGFR激活和肿瘤的发生及转移相关。据报道，60%-80%的结肠癌有EGFR的过度表达。另外，EGFR也是预测结直肠癌和乳腺癌的重要标志物。更重要的是EGFR位于癌细胞表面，因此是开发靶向抗体的理想靶点。抗体可以特定地结合到EGFR的胞外区III结构域，不仅阻止了配体的结合, 而且阻止了在结构域II上延伸结构域的二聚体化（Li S, et al.Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor bycetuximab[J]. Cancer Cell, 2005, 7(4):301-311.；Iida M, et al. Sym004, a novelEGFR antibody mixture, can overcome acquired resistance to cetuximab[J].Neoplasia, 2013, 15(10):1196-1206.）经FDA批准的靶向EGFR的抗体包括西妥昔单抗和帕妥木单抗。它们被用于在临床上治疗KRAS野生型的进展性结肠癌。

表皮生长因子受体（即EGFR）也称作c-erbB l/Herl，其家族成员都是生长因子受体酪氨酸激酶，它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与EGF或TGFa相互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。已发现的该家族第一个成员是表观分子量为 165KD 的糖蛋白。

EGFR 在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中都有表达。在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。由此可知，如果有药物能阻断EGFR 的活性，将会抑制其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。在一些研究中，EGFR抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤细胞株时，表现出累加和协同作用。

EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、喹唑啉pyralo-/吡咯并-/吡啶并嘧啶、配体-毒素和免疫毒素联结物，以及反义核苷酸和EGFR/配体主导的疫苗等。一些体内和体外实验显示抗 EGFR 抗体成功的抑制了表达 EGFR 的肿瘤细胞株的生长。在实体瘤的治疗中，一些抗 EGFR 单克隆抗体单独应用或与传统治疗方法合并应用的治疗结果令人鼓舞。现有技术中已经描述了多种小鼠的抗 EGFR 单克隆抗体，可与EGFR高特异的结合，这些抗体大致可分为两类，一类是可与受体结合但不抑制 EGF结合的抗体，另一类是可与受体结合并且还抑制 EGF结合的抗体。但是患者对鼠源抗体产生的免疫应答限制了这些抗体在人类治疗和体内诊断中的应用。患者会产生人抗小鼠抗体反应（HAMA），从而限制了抗体到达其抗原靶标的能力，使抗体的效能降低。

一些研究人员为了减少HAMA 反应，研制出了人鼠嵌合的抗体，其中小鼠可变区（V）与人恒定区（C）连接。该抗体证明在临床上好于鼠源抗体，但是嵌合抗体的小鼠V 区中仍然含有使患者产生免疫原性的成分，限制了其应用。