[发明专利]一种重组黄曲霉壳聚糖酶和编码基因及制备和应用

说明书

本发明提供了一种高效黄曲霉(Aspergi llus sp.Y2K)壳聚糖内切酶突变体的制备，该突变酶可用于水解壳聚糖，获得寡糖或单糖。该方法主要包括以下步骤：将成熟的重组壳聚糖酶基因突变A286G,C287T两个位点的DNA序列克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X‑33中，即可获得能高效分泌表达、高效降解壳聚糖，高纯度的重组壳聚糖酶突变体，比较没有突变前的发酵酶活力提高了3倍，本发明制备的内切壳聚糖酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

技术领域

本发明提供了一种高效重组黄曲霉壳聚糖酶突变体的制备以及应用。用该方法制备的上清中重组壳聚糖酶突变体达1.02mg/ml，发酵酶活力高达4400U/ml，能高效降壳聚糖产生高纯度的壳寡糖，SDS-PAGE检测分泌酶的纯度达到90％。本发明制备的重组壳聚糖酶突变体具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。

背景技术

壳聚糖(chitosan)最早发现于19世纪，是由自然界中广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的，这种天然高分子具有良好的安全性、生物相容性和微生物降解性。大量研究表明壳聚糖在食品、化工、医药及农业等领域都有广泛的应用前景(高维,丁文平.低分子量壳聚糖的制备及其应用研究[J].武汉工业学院学报,2007,26(3):28-31.)。但由于壳聚糖的溶解性问题，严重阻碍了其资源的有效利用与高值化(邹耀邦,王璐,刘孝波.生物质材料：甲壳素/壳聚糖的溶解性与应用研究进展[J].材料导报,2003,17(5):51-55.)。壳寡糖又名壳聚寡糖或几丁寡糖，作为壳聚糖的下一级产物，具有壳聚糖无法比拟的特性，它具有较高的溶解度和较低的分子量，更容易被生物体吸收，近年来的研究发现，低分子量壳寡糖(如五糖、六糖)还具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特性(单晓雪,郑人源,张涛,等.壳聚糖酶的研究进展[J].成都医学院学报,2007,2(3):192-198.)。

目前壳寡糖的制备大多数是以甲壳动物(虾、蟹等)的骨骼为主要原料，经过脱乙酰基、脱钙、脱蛋白等处理得到壳聚糖，再进一步水解得到壳寡糖(刘幸海,李正名,王宝雷.壳寡糖的制备工艺最新研究进展[J].天津化工,2006,20(1):1-6.)。制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法等。化学降解法产生的衍生物较多，低聚糖得率低且环境污染严重；物理降解法生产成本较高，难以实现工业化；酶法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到了越来越多的重视与关注(叶淑红,孙浩,陈丽,等.产壳聚糖酶菌株的筛选及壳寡糖性质的研究[J].食品研究与开发,2007,28(1):23-27.)。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。