[发明专利]一种快速定量单个微孢子虫孢子海藻糖浓度的方法

说明书

技术领域

本发明定量检测技术领域，具体涉及一种基于单细胞拉曼光谱直接定量分析微孢子虫孢子海藻糖含量的方法。

技术背景

微孢子虫（Microsporidia）是一类细胞内专性寄生单细胞真核生物，目前将其归类为真菌，寄主很广泛，可以感染包括人类在内的无脊椎动物和脊椎动物，目前已发现有150多属，1400余种。微孢子虫对许多极具经济价值的昆虫、鱼类、兔子等都有致病性。其中，家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）是人类最早发现的微孢子虫，主要寄生于家蚕。家蚕微粒子病就是由N.b感染、寄生引起的一种传染性蚕病，可以通过食下传染或胚种传染，是蚕业生产上的毁灭性疫病，家蚕微孢子虫不仅可寄生在家蚕幼虫、蛹、蛾的多种组织内，并能经蚕卵垂直传播给下一代，对蚕业生产尤其是蚕种生产造成严重危害，而且极易导致蚕茧品质和产量的下降，严重影响蚕丝产业链下游经济的发展，被各国列为蚕种生产唯一的检疫病害。

基于微孢子虫对人类社会的影响及其在进化生物学上的重要性，一直是广大学者的研究兴趣。尤其是微孢子虫孢子的发芽机制，因为孢子发芽是微孢子虫侵染寄主的关键起始。而海藻糖在微孢子虫孢子的发芽过程中发挥了重要作用，孢子发芽前期，海藻糖与海藻糖酶因间隔膜的打破而相互接触，在合适的条件下酶活性被激发，催化海藻糖水解为葡萄糖或果糖，孢子内渗透质浓度上升，外界水分在渗透势差的作用下大量进入孢子，极膜层和后极泡吸水膨胀，压迫极丝解螺旋，极帽外翻成衣领状结构支撑着孢子前端极管的弹出。极管弹出刺入寄主细胞后，孢原质开始挤入泡囊形成芽体侵染寄主。有研究表明，有的物种的孢子海藻糖浓度超过1.0 mol L^-1，但在发芽的时候仅有70%左右的海藻糖转化为单糖，引起孢内渗透压升高进而触发孢子发芽。海藻糖浓度高低是否影响孢子的发芽力和侵染力呢，目前还不清楚。

海藻糖是真菌孢子中常见的双糖物质，常规的检测方法有层析法、比色法、气相色谱法、高效液相色谱法及酶法分析。层析法（纸层析、薄层层析）以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的分离分析方法。这种方法比较费时间，而且检测人员可能接触到有机溶剂。蒽酮比色法是糖类（在硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合，产生蓝绿色糠醛衍生物，通过分光光度计来定量。这种方法是非特异性的，会受到其它可与蒽酮试剂反应的物质的干扰。气相色谱也可 以用于海藻糖的分离与检测，但因为海藻糖不是挥发性物质，必需制成相应的挥发性衍生物才能检测。在定量分析海藻糖的方法中，高效液相色谱法（HPLC）定量的准确度和重现性最好，但需要专业的设备。海藻糖酶法分析是最近发展起来的测定方法，其原理是通过海藻糖酶对海藻糖的特异性水解，产生的葡萄糖再用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶系统进行检测，该方法特异性高，分析成本也高，且受酶活力影响。

上述方法都是费时、费试剂且费样品的检测方法，这些方法都需要先破碎孢子壁，把海藻糖从孢子内释放出来，需要较大数量的孢子样品才能达到检测的最小样品要求，因而无法定量微量孢子的海藻糖浓度，更别说单个孢子的海藻糖浓度。而且检测后的孢子样品是被破坏的、没有细胞活性的孢子样品，无法直接分析海藻糖浓度与孢子的发芽力、侵染力相关性。因此，发展一种实时、无损的、快速的测量单个孢子海藻糖浓度的技术方法有非常重要的意义。

参考文献：

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