[发明专利]一种六次甲基四胺的检测方法

说明书

本申请是申请日为2015年05月08日，申请号为2015102340341，发明创造名称为“一种六次甲基四胺的检测试剂盒、检测方法及应用”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体地说是一种六次甲基四胺的检测方法。

背景技术

六次甲基四胺（俗名乌洛托品），分子式C₆H₁₂N₄，属化工原料，被卫生部列入第五批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中，六次甲基四胺被禁止添加到食品当中或在加工食品过程中使用。部分违法者将其掺入腐竹、粉丝、水产品等食品中，会起到增白、保鲜、增加口感、防腐的效果。六次甲基四胺本身属低毒类，可作为药物服用。但其在酸性条件下，能分解出甲醛，甲醛易与体内多种化学结构的受体发生反应，如与氨基化合物可以发生缩合，与巯基化合物加成，使蛋白质变性。甲醛在体内还可还原为醇，故可表现出甲醇的毒理作用，对人体的肾、肝、中枢神经、免疫功能、消化系统等均有损害。

目前，国家标准中还没有关于六次甲基四胺的指定检测方法，六次甲基四胺属于小分子物质，如想要对其进行检测，主要采用仪器检测的方法，比如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱串联质谱法（LC-MSMS）等。这些方法虽然可以精确地进行定性及定量检测分析，但是存在检测仪器昂贵、成本高、需要专门的技术人员来检测、检测时间长、方法操作复杂等缺陷，尤其不适用于食品安全监管现场的快速检测。免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。它可以克服仪器检测法的上述缺陷，能够以其简单、快速、灵敏度高、特异性强、结果直观、无需仪器等高效地应用于食品安全检测领域。免疫学检测方法中应用较广泛的是酶联免疫法，简称ELISA法。但是ELISA法相对更适用于定量检测方法，检测时间相对较长，不适于快速定性检测。因此，为适应市场需求，行业内迫切需要开发一种简单、快速、灵敏度高、特异性强、结果直观、无需精密仪器的六次甲基四胺的定性检测装置及检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种六次甲基四胺的检测试方法，以解决在食品安全检验时，现有方法无法快速、准确地、大批量定性或半定量检测六次甲基四胺的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种六次甲基四胺的检测试剂盒，其特征在于，包括：

检测卡；所述检测卡包括硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜上设有一条含六次甲基四胺包被抗原的检测带和一条含有羊抗兔二抗的质控带；

胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物；以及

磷酸盐缓冲稀释液。

所述六次甲基四胺包被抗原是通过以下方法制备的：配制浓度为15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液；配置浓度为0.1mol/L、pH值为7.4、含有卵清蛋白4.5-5.0mg/ml的磷酸盐缓冲液；将六次甲基四胺溶液缓慢滴加到含卵清蛋白磷酸缓冲溶液中，之后，再加入体积比浓度为25%戊二醛水溶液，混匀，室温静置1小时，4℃静置过夜，装入透析袋，4℃下在0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中连续透析5天，每天换液1次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺: 含卵清蛋白的磷酸缓冲溶液:戊二醛水溶液的添加比例为5-6 mg : 2-5ml : 1-2 ml。

所述胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物是通过以下步骤制备的：

（A）合成六次甲基四胺完全抗原：配制浓度为200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液；配制pH值为7-10、离子浓度为10-1000 mmol、含载体蛋白30-50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4℃冰箱过夜，再装入透析袋中，透析3-5天，每天换液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液质量体积比为：80-120 mg : 1-5ml : 2-3ml；

（B）制备六次甲基四胺多克隆抗体：采用所述六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗体；