[发明专利]一种克隆豆梨PcFRO2基因编码区全序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及克隆豆梨PcFRO2（Pyrus calleryana ferric reduction oxidase 2）基因编码区全序列的方法，属于生物技术领域。

背景技术

铁作为一种重要的微量营养元素，与果树生长发育密切相关，在果树光合、呼吸以及多种生理代谢中起重要作用。如果植物没有主动调节机制获得充足的铁，在碱性或石灰性土壤条件下，大多数植物便会出现缺铁症状，轻度缺铁会引起新叶出现黄化现象，光合效能降低，严重缺铁则会导叶片焦黑枯死，光合作用停滞，生物产量大幅度减少。

在应对碱性或石灰性性土壤的过程中，不同的植物形成了多种适应性的吸收铁机制，其中豆梨吸收铁的过程包括：（1）细胞膜上的H⁺-ATPase分泌质子酸化土壤，增加土壤中三价铁离子的溶解性；（2）三价铁离子螯合物还原酶把三价铁离子转变成二价铁离子；（3）根系中的二价铁离子转运蛋白把二价铁离子从土壤中转运到细胞质内。豆梨不能直接吸收利用三价铁离子，必须先还原为二价铁离子才能被吸收利用，三价铁离子螯合物还原酶活性的提高是豆梨这类植物最典型的特征。豆梨根系中分泌的三价铁离子螯合物还原酶是由PcFRO2基因编码的，因此，PcFRO2基因对豆梨根系吸收利用铁元素起着至关重要的作用。

迄今为止，国内外尚有一些关于梨黄叶病的研究，但绝大多数集中于黄叶病的矫治，如土壤施铁，树干注射，叶面喷施铁等。至于对梨黄叶病缺铁分子水平机理的探讨尚少，尤其对编码三价铁离子螯合物还原酶基因的研究还未见报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种准确、简捷的获取豆梨PcFRO2基因的完整编码区序列的方法，填补了此基因在该物种上克隆的空白，为深入挖掘豆梨PcFRO2基因的功能及应用尊定了基础。

本发明的技术方案如下：

一种克隆豆梨PcFRO2基因编码区全序列的方法，包括下述步骤：

A1、从豆梨嫩根根尖组织中提取总RNA，随后将总RNA反转录成cDNA；

A2、以上述的cDNA为模板，在起始密码子上游区域设计正向引物F1，在终止密码子下游区域设计反向引物F2，进行PCR扩增：

正向引物F1：5'-CCGAAACGGGAAGGATTA-3'；

反向引物F2：5'-CCGAAACGGGAAGGATTA-3'；

通过梯度PCR得到扩增PcFRO2基因的优化PCR反应条件及反应体系：反应条件为：首先94℃预变性2min，然后40个循环（94℃，35s；57℃，30s；72℃，1min 30s），最后72℃延伸7min；反应体系采用20μL体系，其成分包含：10.0 μL 2×Es Taq MasterMix，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH20 7.0 μL；

A3、PCR产物的回收和纯化，采用胶纯化回收试剂盒回收PCR产物，步骤按其说明书操作；

A4、克隆。

上述方法中A1步骤具体操作如下：

(1) 总RNA提取，根据TIANGEN的RNAprep Pure Plant Kit (目录号：DP441)使用说明书进行，优化后操作步骤如下：

a. 取约150 mg嫩根根尖组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μL SL和28μL β-巯基乙醇，立即涡旋剧烈震荡混匀，12,000 rpm离心2 min；

b. 将上清液转移至过滤柱CS上，12,000 rpm离心2 min，小心吸取收集管中的上清液至新的RNase-Free离心管中；

c. 缓慢加入180 μL无水乙醇，混匀，将得到的溶液转入吸附CR3中，12,000 rpm离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

d. 向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

e. 取10 μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μL RDD溶液，轻柔混匀后加入吸附柱CR3中央，室温放置15 min；

f. 向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

g. 向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW，12,000 rpm离心15 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复一次；