[发明专利]松墨天牛dynamin‑1‑like蛋白基因编码全长序列及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体是涉及松墨天牛dynamin-1-like蛋白基因编码全序列及其克隆方法。该基因编码dynamin-1-like蛋白，该蛋白是研究线粒体分裂与囊泡运输的重要材料，具有重要的生理学及医学意义。

技术背景

dynamin-1-like蛋白基因(DLP1)是Dynamin超基因家族成员之一，属于GTP酶类，大部分是在真核生物中发现，但在酵母菌、秀丽隐杆线虫也发现了与之同源的蛋白。主要被定位在线粒体中，与细胞膜重构有关，可能参与细胞内吞作用的囊泡运输，也可能对线粒体形态稳固及分裂后期有关，可能参与过氧化物酶体的分裂后期。研究表明人类的DLP1还是研究阿兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)、癫痫的重要材料，所以对DLP1的研究具有重要的生理学及医学意义。

松墨天牛(Monochamus alternatus)属于鞘翅目(Goleoptera)天牛科(Cerambycidae)墨天牛属(Monochamus)。松墨天牛是一种主要危害马尾松等针叶树种木质部与韧皮部的虫种，它是林业上重要的蛀干害虫，严重影响针叶树种的正常生长，同时其成虫也是松材线虫病(Pinewoodnematode)传播的主要媒介。近几十年来，该虫广泛扩散全国，速度很快，造成的经济损失也比较严重。鉴于松墨天牛DLP1基因目前无人研究，本发明填补了这一空白，对深入研究松墨天牛线粒体分裂、囊泡运输及预防松材线虫病的传播奠定了基础、甚至可以为人类一些重大疾病的预防和治疗提供新思路，具有重要生理学及医学意义。

发明内容

本发明的目的在于提供松墨天牛DLP1基因编码序列及其克隆方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

1、总RNA的提取

将外地采集的松墨天牛活成虫经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的EP管中，并置于-70℃低温冰箱内保存备用。采用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II总RNA提取试剂盒来提取松墨天牛的总RNA。

2、引物设计和3′RACE扩增

在本实验室构建的cDNA文库中，查找并获得了松墨天牛DLP1基因编码5′端序列， 本发明是在此基础之上进行3′RACE扩增，目的在于获得松墨天牛DLP1基因编码全序列。

3′RACE扩增的特异性引物为：

Ma-DLP1-3′-Outer：CAGCATTGTGGAAGTGAAG

Ma-DLP1-3′-Inner：CGCAGACTACCTACTACTAATG

3、目的基因克隆及测序

获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收相应目的DNA片段，同pMD20-T载体进行连接，将连接后的产物转化到E.coli DH5α感受态细胞之中，然后进行AMP抗性蓝白斑的筛选，挑取合适的阳性菌落进行质粒提取。最后经由菌落PCR鉴定后进行测序。

4、序列拼接

将测序正确的序列与实验室已构建的松墨天牛cDNA文库中的DLP1基因序列进行不重复拼接，从而获得松墨天牛DLP1基因编码全长序列。

松墨天牛DLP1基因编码全长序列，此序列如下：

此序列中划线处标示的atg为初始密码子，划线处标示的taa为终止密码子。

根据松墨天牛DLP1基因编码全序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：

本发明获得了松墨天牛DLP1基因编码全序列，补充了松墨天牛GTP酶类的基因。同时，人类的DLP1基因是研究阿兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)、癫痫的重要材料，获得松墨天牛DLP1基因编码全长序列能为新型AD及癫痫疫苗的研发以及治疗奠定一定的基础。通过对松墨天牛成虫的预处理、总RNA的提取、3′RACE扩增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了松墨天牛DLP1基因编码全长序列，该编码全长序列2133bp，共编码710个氨基酸。

具体实施方式

以下实施例将本发明进一步说明。

1、松墨天牛总RNA提取