[发明专利]一种RNA中5‑羟甲基胞嘧啶的检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，特别涉及一种RNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法及其试剂盒。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)最早于1952年在噬菌体DNA中被发现，它能被糖基转移酶介导糖基化修饰，从而使噬菌体基因组在进入宿主后能抵抗宿主限制酶的降解。1972年Penn等在哺乳动物大鼠、小鼠以及卵生动物牛蛙脑组织提取的DNA中也发现了羟基化修饰的胞嘧啶，约占DNA总胞嘧啶的15％左右，但此后的研究未能重复这一结果。直到2009年，Tahiliani和Kriaucionis的两个研究团队在同一期Science中分别报道了5hmC在人、小鼠大脑及胚胎干细胞中有着丰富表达，羟甲基化的概念才又一次进入人们的视野并得到了重视。

5-羟甲基胞嘧啶的分子式是C₅H₇N₃O₂，是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)的羟基化形式，5-羟甲基胞嘧啶是TET家族的酶通过氧化5-甲基胞嘧啶产生的，被称为“第六种碱基”，可以调控基因表达的关闭，是一种重要的表观遗传修饰，可能与去甲基化过程有关，5-羟甲基胞嘧啶的具体作用机制还不明确。5-羟甲基胞嘧啶在哺乳动物的不同组织间存在差异性分布，这种差异还会随着年龄、疾病等因素发生变化。所有的哺乳动物基因组中都含有5-羟甲基胞嘧啶，但是其水平在不同类型细胞中相差很大，在中枢神经系统的神经细胞中含量最高。

5hmC是一种新型的碱基修饰方式，最近的研究证明其在各类疾病中都发挥着重要的作用。最新研究证明5hmC不但在DNA序列中存在，而且还在RNA序列中也存在。虽然检测DNA 5hmC的方法有很多种，如免疫组织化学方法、液相色谱串联质谱方法、高通量测序分析方法等，但很多都不能在RNA 5hmC的检测中使用，因为RNA自身的生物学特点——极易降解。因此寻找方便快捷检测RNA 5hmC的方法就显得非常重要。

目前用于检测RNA 5hmC的方法只有液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析方法。液相色谱串联质谱中，液相色谱负责分离待测物与干扰物，质谱负责检测。样品进样后首先在流动相的携带下进入色谱柱，经过色谱柱分离后，进入质谱进行检测。质谱根据被测物的质荷比(m/z)进行检测，被测物在离子源转换成气相离子进入质谱，在三重四级杆中一级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入碰撞室，在碰撞室内分子离子碰撞裂解，形成子离子进入二级质谱，二级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入检测器。但该检测方法耗时长，所需费用昂贵，不方便，操作较繁琐，样品制备比较麻烦。因此，需要提供一种方便快捷、易于操作、样品制备比较简单的RNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法及其试剂盒。该检测方法可快速对RNA中5-羟甲基胞嘧啶进行检测分析，灵敏度较高，易于操作，样品制备较简单。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种RNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：将总RNA与变性试剂混合，变性，获得变性RNA；

步骤2：将变性RNA结合于硝酸纤维素膜上，烘干，封闭，获得抗原膜片；

步骤3：将抗原膜片与5-羟甲基胞嘧啶抗体进行第一孵育，然后与酶标第二抗体进行第二孵育，显影，获得检测结果。

作为优选，变性试剂为氢氧化钠、甲醛或Tris-HCl。

优选地，变性试剂为氢氧化钠。

作为优选，变性试剂的浓度为0.5～4mol/L。

优选地，变性试剂的浓度为2mol/L。

作为优选，变性的时间为0.5～48h，变性的温度为0～10℃。

优选地，变性的时间为0.5h，变性的温度为4℃。

作为优选，步骤2中结合的时间不少于60min。

优选地，步骤2中结合的时间为15min。

作为优选，结合的温度为15～30℃。

作为优选，步骤2中烘干的温度为60～100℃，时间为0.25～2h。

优选地，步骤2中烘干的温度为80℃，时间为0.5h。

作为优选，总RNA的浓度为12.5～100ng。

优选地，总RNA的浓度为100ng。

作为优选，第一孵育的温度为0～10℃，时间为12～24h。

优选地，第一孵育的温度为4℃，时间为12h。