[发明专利]一种催化合成海藻糖的生物酶及其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成海藻糖的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和现代化的分 离技术的海藻糖合成方法，具体是一种催化合成海藻糖的生物酶及其制备方法。

背景技术

海藻糖（Trehalose）是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键连结而成，分子内不存在 游离的半缩羟基，是一种稳定的非还原性二糖。海藻糖广泛存在于植物（藻类）、细菌、真菌、 酵母和无脊椎动物体内（昆虫）。

由于海藻糖具备稳定的细胞膜和蛋白质结构，海藻糖具有抗冷冻性、保湿性、耐高 温性、干燥抗性、非还原性等良好的加工特性，加之外源性的海藻糖具有良好的非特异性保 护作用，因此广泛应用于食品、医药、精细化工和化妆品等领域。

海藻糖生产方法主要有合成法、发酵法、提取法、酶转化法以及基因工程法。

海藻糖的化学合成法是在2,3,4,6-四乙酰基葡萄糖和3,4,6-三乙酰-1,2-脱水- D-葡萄糖之间产生环氧乙烷加成生成。

发酵法主要步骤是通过采用诱变、细胞融合或基因重组等方法培育出高产海藻糖 的菌株，采用优化培养基和适宜的条件发酵，再采用有效分离提取技术对发酵产物进行精 制。目前可利用的微生物主要包括酵母、革兰氏阳性菌，特别是微球菌属。

提取法主要是指微生物提取法，也可从植物中提取，但该方法成本太高，产率太低 未见工业化应用。微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物为提取源 通过发酵优化等提取出海藻糖，以酵母为主。早期商品化的海藻糖是从酵母中提取的，该方 法主要是培养酵母菌株到对数生长期，然后通过对培养条件的控制，使酵母细胞处于胁迫 环境中（如营养饥饿、高温、高渗透压、干燥和冷冻等），造成酵母菌体内海藻糖的含量显著 增加，可达细胞湿重的20％，然后利用乙醇等有机溶剂从酵母菌中抽提纯化海藻糖。

合成法和提取法产率过低，且成本较高，无法进行工业化应用；而磷酸化酶法需消 耗高能物质，加之磷酸化酶本身不稳定也不适用于工业生产。目前应用较多的是海藻糖合 成酶一步反应法和双酶法。海藻糖合成酶法以麦芽糖为直接底物，工艺简单，转化率高，但 反应时间过长，反应温度低（一般为20-30℃）。而双酶法以直链淀粉为底物，通过两种酶的 反复反应最终形成海藻糖。工业上常用脱支酶进行淀粉初步水解为双酶法提供底物。现代 工业生产中也常常使用基因工程法（特别是构建基因工程菌）与酶转化法结合。

发明内容

为了解决以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成海藻糖的生物 酶。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述催化合成海藻糖的生物酶的核苷酸序 列。

本发明的第三个目的是提供一种催化合成海藻糖的生物酶的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种催化海藻糖生物合成的生物酶，所述生物酶为SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

根据本发明所述催化海藻糖生物合成的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建 的基因工程菌株。

根据本发明所述催化海藻糖的生物合成的生物酶，所述基因工程菌株为大肠杆 菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。

本发明还提供一种编码所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明还提供一种所述的生物酶基因工程的制备方法，包括如下步骤：

（1）首先构建海藻糖的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表 达载体，转化到宿主细胞中；

（2）将阳性克隆挑入LB（Luria-Bertani）液体培养基活化后转接入LB液体培养基中，培 养，最后经发酵，得到催化合成海藻糖用的生物酶。

本发明所述的生物酶制备方法，包括如下步骤：

（1）取原种菌种在斜面培养基划线，37℃，倒置培养过夜。

（2）在斜面上挑取2环菌种至25ml种子培养基（250ml试管）中，37℃，200rpm振荡培 养14小时，制备种子液。

（3）以5%的接种量接种到6L发酵培养基中（10L发酵罐），温度37℃，转速200rpm- 600rpm/min，连续培养36小时，收集菌体细胞。

（4）破碎菌体细胞，释放出海藻糖酶，得到包含海藻糖酶的水溶液。