[发明专利]维生素B12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法

说明书

本发明涉及一种维生素B12检测方法及其样本前处理方法，属于生物样本检测技术领域。该前处理方法包括以下步骤：取待测样本溶液，加入蛋白释放剂和络合剂，所述蛋白释放剂使待测样本中的维生素B12由结合蛋白上释放出来；所述络合剂为具有氰根离子的络合物，所述络合物在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为10¹⁰～10⁴⁵，该络合物在溶液中解离出氰根离子，与上述释放出的维生素B12结合，形成稳定的氰钴胺素，供测定。本发明以低毒的具有氰根离子的络合物替代剧毒的氰化物，利用解离出的微量氰根离子与待测样本中的维生素B12反应，生成稳定的氰钴胺素，达到既能满足样本处理要求，充分处理样本，又不至于产生较大毒性的目的。

技术领域

本发明涉及生物样本检测技术领域，特别是涉及一种维生素B12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法。

背景技术

维生素B12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。维生素B12是B族维生素中迄今为止发现最晚的一种。

维生素B12的结构如下所示：

其特点为：1.分子中心为一个三价钴离子；2.具有咕啉环(一个类似为卟啉环的结构)，该咕啉环的4个N原子与三价钴离子形成4个配位键；3.二甲基吲唑结构的一个N原子与三价钴离子形成一个配位键；4.吲唑与咕啉环之间由异丙烷、磷酸、5'-脱氧腺苷连接；5.R基团可以是OH^-、Cl^-、CN^-等带负电荷的离子，其与三价钴离子形成一个配位键。

维生素B12在体内是与蛋白相结合而存在的，所以在检测血浆等生物样本时，需要对样本进行前处理，使其将维生素B12由结合蛋白上释放出，再进行检测。

目前，临床上对生物样本中的微量维生素B12的检测方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和化学发光免疫分析等。但是，由于从结合蛋白释放的维生素B12具有多种形式，R基团的不同会导致其有不同的稳定性，在采用上述分析方法进行检测时，可能由于维生素B12不同的稳定性导致检测结果出现偏差。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种维生素B12检测的样本前处理方法，采用该方法，能够将待测样本中的维生素B12转变为稳定态进行检测，提高了检测稳定性，并且所用处理剂均为安全性高的试剂，具有可操作性强的优点。

一种维生素B12检测的样本前处理方法，包括以下步骤：

取待测样本溶液，加入蛋白释放剂和络合剂，所述蛋白释放剂使待测样本中的维生素B12由结合蛋白上释放出；所述络合剂为具有氰根离子的络合物，所述络合物在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为10¹⁰～10⁴⁵，该络合物在溶液中解离出氰根离子，与上述释放出的维生素B12结合，形成稳定的氰钴胺素，供测定。

在前期研究中发现，在维生素B12的多种形态中，以CN-络和的结构为稳定结构。因此，常规技术中，普遍使用的是以氰化钠或者氰化钾作为样本前处理液，利用其中的氰根离子与维生素B12结合形成稳定的氰钴胺素，再通过免疫方法，检测出其具体含量，如图1所示。

但是，氰化钠和氰化钾在水溶液中完全电离得到剧毒的氰根离子，氰根离子具有很强的络和性，可与血红蛋白上的铁离子络和，形成非常稳定的络和物，使血红蛋白失去活性，不能正常携带氧气，导致窒息中毒。因此，这两种物质是国家严格管制的剧毒品，健康成年人的致死剂量为0.1g。对于氰化钠和氰化钾的使用，必须考虑周边环境影响，风险评估，危废处理，以及申请建立剧毒品仓库，对人员进行培训，申请购买资质。另外，如在试剂配方中引入这样剧毒的物质，也会对人心理引起恐慌，其本身也具有较大的污染和中毒风险。因此，以氰化钠和氰化钾作为前处理液大量使用，其操作性和可控性很差。