[发明专利]基因工程鼠提高Foxb2表达水平的新功能

说明书

技术领域

本申请属于转基因生物新功能的技术领域，尤其涉及于一种DNMT1敲除鼠可提高 Foxb2蛋白表达水平的新功能。

背景技术

DNA甲基转移酶1，即DNMT1，是一种催化DNA胞嘧啶甲基化的关键酶。DNA甲基化是 生命体感受外界输入信号、调控结构基因表达的重要修饰手段，是表观遗传学的主要范畴 之一。DNMT1在维持DNA甲基化特征及DNA的复制修复方面都有重要的作用。DNMT1作为一种 基因表达的调控蛋白，其在不同生理条件下的对靶基因选择的差异最终影响到细胞及组织 整体功能的改变。

转基因动物是指通过基因工程的手段使某些基因缺失或增量表达而获得的动物 品种，其中转基因小鼠，又称基因工程鼠，在现代神经生物学、病理学、毒理学等学科的研究 中发挥着不可替代的作用。基因工程鼠对研究蛋白间的相互作用、调控因子对靶蛋白的作 用以及表观遗传学的调控作用均有很大的价值。

Fox蛋白是一类转录因子，主要在与细胞生长、繁殖、分化及寿命延长等相关的基 因表达方面起重要的调控作用。相当多的Fox蛋白在胚胎发育中起作用，且在细胞分化过程 中Fox蛋白能够与紧缩后的染色质进行结合。Foxb2是Fox蛋白的成员之一，其以典型的“叉 头”结构作为DNA结合域，它作为hedgehog等信号通路的下游分子，在中枢神经系统的发育 过程中具有扮演一定的角色。

发明内容

本申请所用的基因工程鼠，即敲除了DNMT1基因的C57BL/6J小鼠，购自北京唯尚立 德生物科技有限公司。用于对照的C57BL/6J小鼠购自安徽医科大学。

敲除了DNMT1基因的C57BL/6J小鼠，即所述的“基因工程鼠”，它的大脑皮层的 Foxb2蛋白的表达水平提高到正常的对照鼠的2.7倍。

蛋白提取和检测的过程如下：

将培养至1个月的基因工程鼠及对照的C57BL/6J小鼠各6只处死并分别取出其左脑的 大脑皮层组织。将上述皮层组织用眼科剪剪成小块后用匀浆机进行匀浆，充分研碎，将组织 匀浆化。将匀浆液转入1.5ml的离心管中，12000rpm在4^oC下离心15min。离心管中的液体 分三层，提取中间无色液相，转入新的离心管中。

将提取的蛋白首先通过本领域常规的BCA法测定其蛋白浓度。随后用等体积的2乘 的SDS上样缓冲液混合后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳的条件设定为电压120V，电泳时 间1.5h。随后用硝酸纤维素膜进行转膜，转膜条件为60V转移2h。将膜清洗后浸泡入含 Foxb2抗体的溶液中4^oC孵育过夜。随后经多次洗净后使用本领域常用的二抗进行孵育，最 后进行化学显影，完成蛋白印迹实验。所获得的显影条带的密度值测定及相互间的比较使 用ImageJ软件来完成。

实验组和对照组所获得的Foxb2蛋白的表达量的比较如图1所示。

从图1中可以看出，基因工程鼠的Foxb2蛋白的表达量是对照鼠的2.7倍。

本申请证实了在小鼠中枢神经系统中DNMT1对Foxb2的表达水平有显著的调控作 用，表明了DNMT1的缺失导致了包括转录因子等元件的表达异常，证明了DNMT1在神经系统 发育中起到不可或缺的调控作用。

附图说明

图1转基因鼠和对照鼠大脑皮层的Foxb2蛋白的表达水平

Control指对照鼠；DNMT-KO指本申请所述的基因工程鼠。

具体实施方式

实施例1

蛋白提取和检测的过程如下：

将培养至1个月的基因工程鼠及对照的C57BL/6J小鼠各6只处死并分别取出其左脑的 大脑皮层组织。将上述皮层组织用眼科剪剪成小块后用匀浆机进行匀浆，充分研碎，将组织 匀浆化。将匀浆液转入1.5ml的离心管中，12000rpm在4^oC下离心15min。离心管中的液体 分三层，提取中间无色液相，转入新的离心管中。

将提取的蛋白首先通过本领域常规的BCA法测定其蛋白浓度。随后用等体积的2乘 的SDS上样缓冲液混合后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳的条件设定为电压120V，电泳时 间1.5h。随后用硝酸纤维素膜进行转膜，转膜条件为60V转移2h。将膜清洗后浸泡入含 Foxb2抗体的溶液中4^oC孵育过夜。随后经多次洗净后使用二抗进行孵育，最后进行化学显 影，完成蛋白印迹实验。所获得的显影条带的密度值测定及相互间的比较使用ImageJ软件 来完成。