[发明专利]一种植物愈伤组织遗传转化和植物组织培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物愈伤组织遗传转化和植物组织培养方法，尤其涉及一种通过大豆下胚轴作为外植体，诱导产生大豆愈伤组织，在基因枪、超声波和表面活性剂辅助下进行农杆菌侵染，进而产生转基因大豆植株的方法。

背景技术

转基因技术广泛应用到大豆生物技术育种当中。当前很多实验室都是利用大豆子叶节外植体直接进行遗传转化操作，然而这种方法缺点也是非常明显，如转化效率低、工作量大、随机性强、嵌合体多，受大豆基因型限制，很多大豆品种不能作为转化的受体。利用大豆下胚轴诱导的愈伤组织进行遗传转化可以克服大豆子叶节外植体局限，虽然Polacco早在1976年(PolaccoJC.1976.Nitrogenmetabolisminsoybeantissueculture.PlantPhysiol.,58:350-357)就发表了利用下胚轴诱导愈伤的方法，但没有再生成完整的植株，也没有用它来进行大豆的遗传转化。

在大豆的遗传转化过程中，农杆菌介导的遗传转化和基因枪直接轰击这两种方法被广泛使用，但农杆菌介导的愈伤组织转化存在侵染率低、分化胚状体畸形多以及再生完整植株困难等问题。基因枪直接轰击因为外源基因完整整合到大豆基因组中的几率很低、嵌合体高、筛选量大等原因现在已经很少使用。如何提高农杆菌侵染愈伤组织的效率，成为大豆遗传转化能否成功的关键。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种提高农杆菌侵染愈伤组织的效率的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提高农杆菌侵染愈伤组织的效率，以提高大豆遗传转化的成功率。

为实现上述目的，本发明提供了一种大豆愈伤组织遗传转化方法。

在本发明的较佳实施方式中，该植物愈伤组织遗传转化方法包括以下步骤：

1)诱导产生植物愈伤组织；

2)利用基因枪轰击步骤1)中的愈伤组织产生所述微创伤口；

3)利用农杆菌在含有表面活性剂的侵染培养基中对步骤2)中的愈伤组织进行侵染，并利用超声波进行处理；

4)对侵染后的愈伤组织进行筛选分化和继代培养。

进一步地，基因枪轰击的参数为：金粉直径为1μm、真空度为28英寸汞柱、压力为900psi以及轰击距离为9cm，金粉不包裹质粒。

优选地，将淡黄色的愈伤组织在无菌的滤纸上密集摆放成直径为1-2cm圆形，然后进行轰击。

进一步地，表面活性剂为SilwetL-77，其浓度为0.01-0.03％。优选地，表面活性剂SilwetL-77的浓度为0.02％。

进一步地，超声波处理的功率为60-240W，超声处理时间为1-3秒。优选地，超声处理的功率为120W，超声处理时间为2秒。

进一步地，上述植物为大豆，步骤1)包括，将大豆种子消毒及萌发，将萌发后的下胚轴从中间剖开，随后诱导产生愈伤组织。

优选地，挑选饱满、干净的大豆种子，用氯气消毒14-18小时。脐向下种入萌发培养基中，24℃暗培养，萌发5天。切出5mm下胚轴，从中间剖开，使其平的一面贴在诱导培养基上，24℃暗培养直至产生愈伤组织，愈伤组织每两个星期继代一次。

进一步地，步骤3)中的侵染为在侵染培养基中振荡培养20-40分钟，农杆菌选自EHA105、EHA101或LBA4404。优选地，所述振荡培养的时间为30分钟。

进一步地，步骤4)包括：先将侵染后的愈伤组织暗培养3天，在第一除菌培养基中清洗侵染后的愈伤组织3-5次，并在第一除菌培养基中培养1-2小时；随后在第二除菌培养基中振荡培养6-8天，转速为60r/min，光周期16h/天，温度25℃；之后在筛选和分化培养基中进行筛选和分化，光照16h/天，温度25℃，每隔两周更换一次培养基。

进一步地，侵染培养基为：1/10×MS盐、B5维生素、3％蔗糖、2.8mg/LFeSO₄·7H₂O、3.8mg/LNa₂-EDTA、3.9g/LMES、0.04g/L乙酰丁香酮、0.02％SilwetL-77和0.3mg/LIAA，pH值为5.4；

第一除菌培养基为：除去硝酸盐的MS盐、10mMNH₄NO₃、30mMKNO₃、B5维生素、3％蔗糖、5mM天门冬酰胺、5mg/L2,4-D、200mg/L头孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L万古霉素，pH值为5.7；