[发明专利]一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）根据合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP的氨基酸序列，构建出其目的基因PFMAP，将PFMAP经限制性内切酶Bam HI和Xho I双酶切，与同样经Bam HI和Xho I双酶切的原核表达质粒PGEX-6P-1相连接，制得原核重组表达载体PGEX-6P-1-PFMAP，将原核重组表达载体经热激转化至大肠杆菌Rosetta（DE3)感受态细胞，制得重组工程菌株DE3-PGEX-6P-1-PFMAP；

（2）将重组工程菌株DE3-PGEX-6P-1-PFMAP在已灭菌的含有氨苄青霉素和氯霉素的LB大肠杆菌培养基中培养，添加IPTG诱导培养后，离心收集菌体，将菌体超声破碎后收集沉淀，并用SDS-PAGE检测，将含有目的蛋白的沉淀备用；

（3）利用GST琼脂糖亲和层析分离纯化含有目的蛋白的沉淀，即为合浦珠母贝肉抗氧化肽；

步骤（1）中目的基因全长序列如下：

5’-

CGCGGATCCATGAATGGTGGTGCAGGTCTGCCTGGTAAACGTGAGCGTAATGGTGGTGCTGGCCTGCCAGGTAAACGTGAACGCAACGGTGGCGCAGGTCTGCCGGGCAAGCGCGAACGTAACGGTGGTGCTGGTCTGCCGGGTAAACGCGAGCGCAACGGTGGTGCGGGTCTGCCTGGCAAACGTGAACGTAATGGTTAACTCGAGCGG-3’。

2.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：步骤（1）中根据合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP的氨基酸序列，构建出其目的基因PFMAP的具体过程为：根据合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏好密码子设计出其对应的mRNA序列，并进一步构建其核苷酸全长序列，根据其全长序列，合成对应的两条单链，将两条单链进行PCR变性反应，构建出合浦珠母贝肉抗氧化肽目的基因PFMAP。

3.根据权利要求2所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：进一步构建其核苷酸全长序列的过程是：在mRNA序列的两端加入内切酶Bam HI和Xho I的碱基序列，并在内切酶Bam HI和Xho I的碱基序列两端分别加上3~5个保护碱基，从而构建出合浦珠母贝肉抗氧化肽的核苷酸全长序列。

4.根据权利要求3所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：在内切酶BamHI的左边加上CGC三个保护碱基；在内切酶XhoI的右边加上CGG三个保护碱基。

5.根据权利要求2所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：PCR变性反应时的温度为92~96℃，变性时间为2~5 min。

6.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：步骤（2）中添加IPTG诱导培养时，温度为30~40℃，在转速200~250rpm诱导培养3~5h。

7.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：步骤（3）中利用两次GST琼脂糖亲和层析分离纯化含有目的蛋白的沉淀，即为合浦珠母贝肉抗氧化肽。

8.根据权利要求7所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，其特征是：将第一次GST琼脂糖亲和层析纯化并酶切过后样品过第二次GST琼脂糖亲和层析，收集流出液，将收集到的组分进行Tricine-SDS-PAGE检测，含有目的蛋白的沉淀即为合浦珠母贝肉抗氧化肽。