[发明专利]一种分离尿液中外泌体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学与细胞生物学领域，具体地讲，涉及一种分离尿液中外泌体的方法及试剂盒。

背景技术

尿液不仅能提供关于肾的疾病标记物，同样能提供关于尿道及前列腺等的标记物。这些生物标记物能够游离存在于尿液或存在于由膜双层所包裹的外泌体中。尿液外泌体是直径为40-100nm的小囊泡，起源于细胞内吞作用，当一个多泡小体与所有肾单元段的细胞膜融合之后而被分泌到尿液中。尿液外泌体不仅包含蛋白质，同时也包含有功能性的miRNA及mRNA分子，这些在靶细胞中能够被翻译成为蛋白质而介导细胞间的通讯。这些功能性miRNA/RNA分子被证实能作为肾功能障碍及结构性损伤相关的分子标记物之后，研究对于尿液外泌体的研究兴趣异常浓厚，于是激发了新一轮对于分离外泌体及从外泌体中提取这些分子的热情。

最经典的从体液中分离外泌体的方法是基于连续低温梯度超速离心的方法。这种方法从尿液中分离外泌体既费时，又需要昂贵的超高速离心机，每次都只能处理较少数量较小体积的样本，因此限制了其临床应用的可能性。最近几年，已经有一些成熟的外泌体提取试剂盒相继上市，这些试剂盒不需要特殊设备，可以方便快捷地提取外泌体及其所携带的RNA。此类试剂盒中，有的是利用特殊设计的过滤器过滤掉非外泌体成分，同时把外泌体中的RNA成分释放出来，直接用于接下来的实验；有的则是高分子聚合物的体积排阻效应，把外泌体沉淀出来。这样一来，从体液中分离外泌体变得省时省力，且成本大大降低。

不同的试剂盒在分离外泌体的效率方面差别明显。由于不同体液之间的生化特性等的差异，制定改进适用于特定体液如尿液中外泌体分离的方法，如何在目前标准的分离操作的技术上再进一步提高分离的效率，使得其能满足后续的蛋白及RNA分子的分析等要求，显得十分必要。

人体正常排出的尿液中富含Tamm–Horsfall蛋白（THP）。它是一种糖蛋白，生理条件下，其在尿液中由单体形式聚集形成分子量巨大的多聚体。尿液THP多聚体之间形成的网格状结构会捕获相当数目的外泌体。由于THP丰度较高，因此在一定程度上降低了尿液中外泌体的产量。研究发现，在加入二硫苏糖醇(DTT)之后，THP的多聚化网格能够被打乱，从而能够从中释放外泌体，增加外泌体提取的产量。另外，较低的温度会有利于THP的多聚化及沉淀，因此，适当提高操作及孵育温度可以减少外泌体的损失。

发明人在之前的研究实践中，先后采用了不同的方法分离尿液中的外泌体，对不同的外泌体富集和RNA提取的方法进行了比较，同时基于上述的背景，对尿液中外泌体的分离方法进行改进，提出了本发明所采用的技术方案。

通过比较实验证明，利用本发明所提供的方法能够从每ml尿液中获得最大数量的外泌体颗粒。与优选方案的标准的ExoQuick-TC的操作流程相比，这种方法同样也能产生较高数量及更优质量的外泌体miRNA和mRNA。因此，这为尿液外泌体分离及尿液外泌体分子标记物的开发提供了一个有用的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于开发一种低成本高效率的方法来分离提取尿液中的外泌体。

为了实现本发明的目的，本发明提供的一种简单快捷高效分离尿液中外泌体的方法，步骤如下：

S1.收集尿液，离心，保留上清液（SN1）。具体地，

S1A. 在无菌容器中收集第一次的尿液样本；

S1B. 在每50ml尿液中加入1ml PIC溶液以减少蛋白的降解；

S1C. 在37℃条件下，将10ml尿液/PIC混合溶液17,000 × g 离心10分钟；

S1D. 转移上清液SN1到新的管中并留存。

S2.使用二硫苏糖醇DTT处理底部沉淀；具体地，

S2A. 加入500µL分离溶液重悬沉淀，涡旋30秒；

S2B. 加入100mg DTT使得最终浓度为200mg/mL；

S2C. 在37℃条件下孵育样品10分钟，在孵育期间，每隔2分钟涡旋振荡直到沉淀完全溶解。

S3. 处理后的混合液经离心获得上清（SN2），与第一次得到的上清SN1混合；具体地，在S2C所得到的重悬液中加入1mL分离溶液，混匀，在37℃条件下，17,000 × g 离心10分钟，得到上清SN2，将其与第一次得到的上清SN1混合。

S4.将特定体积的商业化外泌体沉淀试剂加入到总的上清液中（SN1+SN2），混匀后在4℃孵育至少12个小时；具体地，