[发明专利]一种青霉素G酰化酶突变体

说明书

本发明通过基因工程构建了一种青霉素G酰化酶突变体，与来源于无色杆菌(Achromobacter sp.CCM 4824)的野生型青霉素G酰化酶相比，本发明的青霉素G酰化酶突变体的合成性能得到大幅度提高，合成产物/水解产物值S/H最高达到22.3，是野生型酶的3.9倍，可高效地催化合成多种β‑内酰胺类抗生素。在侧链与母核比为1.05:1时，母核6‑APA、7‑ADCA、7‑ACCA和7‑APRA的转化率达到99.0％以上，具有广阔的工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种通过基因定点突变方法获得的合成性能提高的青霉素G酰化酶突变体、及其在生产β-内酰胺类抗生素中的用途。

背景技术

青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是制备半合成β-内酰胺类抗生素中的重要用酶，该酶主要用于水解青霉素G和头孢菌素G，生成相应的化合物母核比如6-氨基青霉烷酸(6-AminoPenicillinic acid，6-APA)和7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-Amino-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA)(Abian et al.,Biotechnol Prog,2003，19(6)，1639-42，2003)；还可用于催化母核6-APA、7-ADCA或其他母核与各种D-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素(半合成青霉素和头孢霉素)(Bruggink et al.1998；Yang and Wei 2003；Youshko et al.2004；Gabor et al.2005)。

酶法合成β-内酰胺抗生素的研究开始于上世纪60年代。相对于化学法(Wegman etal.,Advanced Synthesis&Catalysis,343(6-7),559-576,2001)，由于其具有不使用有机溶剂、反应条件温和、以及环保等优点，酶法合成β-内酰胺抗生素逐渐成为β-内酰胺抗生素工业研究中的一个热点(Giordano,Ribeiro,and Giordano,Biotechnology Advances,24(1),27-41,2006)。理论上，β-内酰胺类抗生素的酶法合成可通过下述两种途径实现(Kasche.Enzyme and Microbial Technology,8(1),4-16,1986)，即1)热力学控制，即逆转水解反应；和2)动力学控制，即酰基转移。动力学控制的催化机制涉及酶和酰基供体反应，形成酰基酶中间体，当中间体遇到β-内酰胺母核即可发生耦合，形成半合成β-内酰胺抗生素；而水作为竞争性亲核性试剂，引起反应物和产物的水解，当产物合成速率与产物水解速率相当时，该合成产物量达到最大值。

目前，通过动力学控制途径，利用青霉素酰化酶催化供体酰基转移到β-内酰胺类抗生素母核来生产半合成β-内酰胺类抗生素的酶法工艺已日益成为化学合成法的有效替代(Bruggink et al.1998；Wegman et al.2001)。

与传统的化学合成法相比，β-内酰胺抗生素的酶法合成面临的主要问题是：在合成抗生素的同时又发生两个副反应，即1)水解活化的酰基供体和2)水解生成的抗生素，从而导致酰基供体和生成的抗生素的减少，进而造成了母核转化率偏低，即合成产物/水解产物(S/H)的比值偏低，而且酶自身的特性对S/H值的影响依然是最重要的(Alkema et al.,Eur.J.Biochem,270(18),3675-83,2003)。利用蛋白质工程来改善青霉素G酰化酶的合成性能已有报道(Alkema et al,Protein Eng.,13(12),857-63,2000)。在大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶中，αR 145、αF146和βF24这三种氨基酸位于酰化酶与青霉素G结合的口袋位置，对酶的合成性能具有关键的作用(Alkema et al.,Protein Engineering Design&Selection,17(5),473-480,2004)。