[发明专利]基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法

权利要求书

1.一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是，具体包括 如下步骤：

(1)预处理，取血浆样品置于离心管中，加入预处理液P，对血浆样品进行 预处理；

(2)配置结合液B，在两步温控条件下采用羟基磁珠特异性吸附样品中的 DNA；

(3)洗涤，配置洗涤液W1和W2对吸附有DNA的磁珠进行清洗；

(4)加入洗脱液T，在物理强化作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进 行磁珠分离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离 DNA，所述的物理强化作用为漩涡震荡、超声波、高温中的一种或多种组合； 其中，预处理液P：0.5-3％(w/v)蛋白酶K，1-3mM氯化钙；

磁珠悬浮液：20％(w/v)纳米磁珠；

结合液B：92-98％(v/v)异丙醇，1-3％(v/v)非极性溶剂，1-5％(v/v)磁珠 悬浮液；

洗涤液W1：5-20mM三羟甲基氨基甲烷，1-5mM乙二胺四乙酸，60-75％(v/v) 乙醇；

洗涤液W2：70-80％(v/v)乙醇；

洗脱液T：8-10mM三羟甲基氨基甲烷，pH＝8.0。

2.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其 特征是：

(1)预处理，取血浆样品置于离心管中，加入预处理液P，在50-60℃水浴 中保存0.5-1h；

(2)吸附，向经过预处理的样品中加入结合液B；漩涡振荡15-30s；在 50-60℃水浴中反应3-5min；从水浴中取出离心管，漩涡振荡15-30s；使 用旋转混合仪，在室温条件下反应5-10min；计时结束后，在3000-4000g条 件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计 时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；

(3)洗涤，首先盐洗涤去除杂质，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离 心管中加入洗涤液W1，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条 件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计 时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；然后进行醇洗涤去除盐分，向完成 吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W2，漩涡振荡2-3min； 静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上， 静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞 开管口室温放置10min以便乙醇挥发；

(4)洗脱，向完成第二步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗脱 液T，将离心管漩涡振荡1-2min后置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超 声清洗机反应15-30s，取出离心管，在50-60℃水浴中保存2-3min；再次 将离心管置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30s，取出 离心管，室温放置5-10min；计时结束后，将离心管放在磁力架上，静置1-2 min进行磁珠分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的 血浆细胞游离DNA。

3.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其 特征是：所述的磁珠为羟基修饰的超顺磁纳米磁珠，粒径为300-1000nm。

4.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其 特征是：所述步骤(1)预处理中，为保证漩涡振荡混匀的效果，所提取的 血浆样品量不得超过所使用离心管最大装液量的2/15。

5.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其 特征是：所述步骤(1)预处理中，预处理液P的用量为血浆样品量的1/10～1/5。

6.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其 特征是：所述的步骤(2)吸附过程中，结合液B的用量为血浆样品量的3～4 倍。