[发明专利]一种基因重组长效人促肾上腺皮质激素及其制备方法

说明书

所属技术领域

本发明采用基因工程、分子生物学等方法，制备出保留了人促肾上腺皮质激素(ACTH)促进糖皮质激素产生的作用并且在血液中不易被代谢的基因重组长效ACTH。

背景技术

血液当中存在多种降解蛋白质的酶类，天然存在的野生型人ACTH的体内半衰期很短，只有约15分钟。ACTH在血液中的降解主要是由血液中的蛋白酶引起的，我们在分析ACTH结构当中的血液蛋白酶降解位点的基础上，构建了野生型以及定点突变的多种ACTH-pET30a原核表达质粒，从中筛选出不易被蛋白酶降解的ACTH点突变体。ACTH是一种多肽，分子量只有4.5kD，在工程菌中不易单独表达纯化；所以我们在ACTHcDNA的5’端连接一段编码6个组氨酸的组氨酸标签(HisTag)以及一段多肽连接物(简称Linker，核苷酸序列共计144bp，表达5.3kD的多肽)的核苷酸序列，表达的融合蛋白不但可以抑制发酵阶段降解，同时提高ACTH在裂解液中的溶解度，还可以用Ni柱初步纯化带有组氨酸标签的蛋白。为了在多肽表达以后去除组氨酸标签，我们在HisTag-Linker与ACTH序列之间加入一段肠激酶(EK)底物“天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－赖氨酸(DDDDK)”的编码核苷酸序列(简称EKst)。这样得到的融合序列简称为“HisTag-Linker-EKst-ACTH(融合核苷酸序列共计285bp，表达的融合蛋白约10.6kD)”。因为肠激酶的切割位点恰好在DDDDK氨基酸序列之后，工程菌中表达出来的带有组氨酸标签的ACTH融合蛋白在基因重组肠激酶(recombinantEK)的作用下可以去除全部的HisTag-Linker肽链和DDDDK序列，得到不带有多余氨基酸残基的ACTH多肽。

采用柱层析方法分离纯化出野生型以及各种点突变的ACTH多肽以后，通过动物体内实验以及小鼠肾上腺皮质瘤Y1细胞体外实验，筛选出保留ACTH促进糖皮质激素产生作用并且在血液中不易被代谢的基因重组长效人ACTH。经过与野生型人ACTH对比，我们发现：ACTH的第5位谷氨酸突变为天冬氨酸(E5D)不但可以保留天然ACTH的生物学活性，而且在血液中比野生型更加稳定，可以作为长效ACTH应用。

本专利说明书描述一种保留了天然ACTH促进糖皮质激素产生作用的在血液中不易被代谢的突变型ACTH(E5D)及其制备工艺。

发明内容

1.发明的目的

制备高纯度的、保留了天然ACTH促进糖皮质激素产生的生物活性的、在血液中不易被降解的基因重组长效人促肾上腺皮质激素(ACTH)。

2.发明的技术方案

见附图1。

3.发明的有益效果

本发明所制备的基因重组长效人ACTH，因其不但具备天然野生型ACTH的生物学活性而且在血液中降解较慢，所以可以降低患者接受ACTH注射给药的剂量和次数，降低成本。

另外，医药市场上现有流通的ACTH是从猪的脑垂体中提取，可能携带动物病毒。本发明所采用的基因工程制备方法，不但可以获得高纯度的基因重组长效人ACTH，并且在制备过程当中不使用动物材料，所以基本上消除了传播动物病毒的隐患。

具体实施方式

1.ACTH突变体的设计、原核表达体系构建以及及表达纯化

1.1ACTH突变体的设计

ACTH的活性区域是氨基(N)端的1-24肽段，羧基末端的第25-39肽段即使被去除或代谢掉依然具有活性，所以我们针对ACTH的1-24肽段设计点突变位点，不但要使其不易被血液中的蛋白酶降解，还要保留ACTH的活性。我们利用CutDB蛋白酶数据库分析了人ACTH中可能的酶切位点(见表1)，在此基础上设计了多种氨基酸点突变ACTH多肽，包括本发明专利所描述的第5位谷氨酸突变为天冬氨酸的ACTH(E5D)。(参见“说明书核苷酸和氨基酸序列表”)

表1.ACTH中的血液蛋白酶切割位点

1.2ACTH原核表达体系的构建及其表达纯化

我们表达了野生型(WT)ACTH、ACTH24(具有活性的氨基末端1-24肽段)以及人工设计的ACTH(E5D)，后者与野生型仅相差1个氨基酸，采用同样的表达和分离纯化方法进行制备，具体如下：

1.2.1构建表达载体